蛋白质浓度测定——双缩脲法

蛋白质浓度测定——双缩脲法

[原理]

将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）。

双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结合生成紫色络合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中的肽键类似双缩脲结构，故亦能呈双缩脲反应。

在一定的浓度范围内，颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。

将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋白质溶液同时与双缩脲 试剂 反应，并于540nm比色，可通过标准浓度蛋白质绘制的标准曲线，求得未知样品蛋白质的浓度。

凡含有一个肽键和一个-CSNH2、-CRHNH2、-CHNH2-CHNH2-CH2OH、-CHOH-CH2OH、-CHOH-CH2NH及乙二酰二胺等物质也有此反应。

本法操作简便，迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度较低，蛋白质量须在1～20mg/ mL方有较佳结果。在需要快速，但准确性要求不高的测定中，常用此法。

[方法与步骤]

标准曲线的绘制

取6支试管从0～5编号，按下表分别加入各 试剂 ，每加一种试液均须混匀，加毕后于室温放置30分钟，然后以0号管作为空白对照管，540nm处测定各管A值。

管号	0	1	2	3	4	5
标准酪蛋白/mL 蒸馏 水/mL 双缩脲试剂/mL	0 1.0 4.0	0.2 0.8 4.0	0.4 0.6 4.0	0.6 0.4 4.0	0.8 0.2 4.0	1.0 0 4.0

以标准酪蛋白（mg）为横坐标，A 540值为纵坐标，绘制标准曲线。

未知浓度的样液测定

可用牛奶中提取的酪蛋白配制溶液。未知酪蛋白浓度的样品测定3管。方法步骤与上述标准曲线制作过程的5号管相同，仅用未知浓度酪蛋白溶液1.0mL代替标准酪蛋白。

标准曲线的制作与未知浓度蛋白测定过程是同时进行的。

根据未知浓度酪蛋白试液的A540值，在标准曲线上查出其对应的蛋白毫克数，即为所测酪蛋白溶液的质量浓度(mg/mL)。