存在干扰物质条件下的蛋白质浓度测定实验

材料

牛血清白蛋白（BSA)

脱氧胆酸钠（0.15%)

三氯乙酸钠（TCA;72%)

试剂

试剂 A

试剂 B

(配方，见 试剂的配制  pp.234~240)

操作程序

1) 用蒸馏水配制 lmg/mlBSA 溶液，分装，冻存于-20℃备用。

2) 作标准曲线，于 1.5-ml 微量离心管中配制下列混合物：

3) 用蒸馏水稀释膜蛋白样品（1:10)，分別取 5-ul、10-ul、20-ul 等分试样供测定。对于已溶的膜蛋白或 WGA 柱层析组分，不必稀释，取 10ul 即可。另取 10ul 缓冲液于空白对照管，用以测定缓冲液组分的吸收值。
注：如无干扰物质、其含量可忽略或经适当控制，则第 4~8 步可省略。在这样的情况下,用蒸馏水将每个样品稀释至 0.4 ml。

4) 用蒸馏水稀释膜蛋白样品至 1 ml。

5) 每管加 0.1 ml 0.15% 脱氧胆酸钠。混合，室溫放置 10 min。

6) 每管加 0.1 ml 72%TCA。混合，室温下微型离心机离心 15 min。

7) 弃上清。可有效地用吸管吸出。

8) 每管加 0.4 ml 蒸馏水。

9) 每管加 0.4 ml 试剂 A，震荡混匀，室温放置 10 min。

10) 每管加 0.2 ml 试剂 B, 立即混合。室温孵育 30 min。

11) 750nm 下读吸光度。
注：在 2 h 之内读吸光度，除非各样品组中都包含有标准蛋白样品。室温下每小时腿色为 1%~2%, 将 8~10 步的体积缩小 10 倍，增加其灵敏度，此法可容易地转为微量测定。除作标准曲线时，蛋白用量减为 0.1~10ug 外，1~7 步均与常量测定同。

12) 以标准样品管中的蛋白量对 750nm 吸光度作图，绘出标准曲线。

13) 根据各被测样品在 750nm 处的吸光度，从标准曲线査出该样品的蛋白含量。