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        蛋白质浓度测定——Folin-酚试剂法

        互联网

        8211

        蛋白质浓度测定——Folin-酚试剂法

        [原理]

        实验室常规测定蛋白质含量方法中,以Lorry等人发展的Folin-酚试剂法应用最为普遍。该方法的优点是:灵敏度高,较紫外吸收法灵敏10~20倍,双缩脲法灵敏100倍;操作简单快速,不需要复杂的 仪器 设备。但它的不足之处是反应过程中受干扰因素较多。

        Folin-酚 试剂 由 试剂 A和试剂B两部分组成。在Folin-酚试剂法中,蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液(试剂A)起作用生成紫色络合物(类似双缩脲反应)。

        由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在,该络合物在碱性条件下进而与试剂B(磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成)形成蓝色复合物,其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。

        通过比色测定,参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线,可确定待测样品的蛋白质含量。本法可测定蛋白质含量的范围在25~250μg/mL。

        由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同,致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致,产生误差。如果所用溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2” 、“-CS-NH2”基团的化合物,或者溶液或样品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时,会给本方法的测定带来干扰。

        磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂B)仅在酸性条件下稳定,而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行,因此当试剂B加入后应当立即充分混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应,这对于结果的重现性非常重要。

        [方法与步骤]

        1、标准曲线的绘制

        取六支 试管 ,标明编号(0~5),放置在 试管 架上,在试管内分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准酪蛋白溶液,用 蒸馏 水补足至每管总体积1.0mL。再加入新配制的试剂A 5.0mL,充分混合,在室温下放置10min。各管中加入0.5mL试剂B,立即摇匀,然后在室温下放置30min。以零号管作空白对照,在660nm波长下比色测定。

        以标准蛋白毫克数为横坐标,A660值为纵坐标绘制标准曲线。

        2、未知蛋白浓度的测定

        方法与步骤与上述第5管相同,用1.0mL未知浓度蛋白溶液代替标准蛋白溶液。未知浓度蛋白测定应与标准曲线制作过程同步进行。

        根据未知浓度蛋白溶液的A660值,运用标准曲线图,查得所对应的蛋白毫克数,计算蛋白溶液的浓度(μg/mL)。实验(五) 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

        [原理]

        考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色,最大光吸收 在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

         

        蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合,在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,可测微克级蛋白质含量。

        [方法与步骤]

        1、标准曲线绘制

        取6支试管,按下表加入各试剂。

        管号

        试剂

        0

        1

        2

        3

        4

        5

        100μg/ml牛血清白蛋白溶液/mL

        0

        0.2

        0.4

        0.6

        0.8

        1.0

        蒸馏 水/mL

        1.0

        0.8

        0.6

        0.4

        0.2

        0

        考马斯亮蓝液/mL

        5.0

        5.0

        5.0

        5.0

        5.0

        5.0

         

        加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后,摇匀,放置2min后,在595nm波长下比色测定,记录A 595

        以各管相应标准蛋白质含量(mg)为横坐标、A 595 为纵坐标,绘制标准曲线。

        2、样品测定

        试管 中加自制蛋白质样品1.0mL ,再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀,放置5min后,在595nm波长下比色,记录A 595

        根据所测A 595 从标准曲线上查得蛋白质含量。

        注意事项

        (1) 如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。

        (2) 测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于 比色杯 壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的 比色杯 洗干净。

        考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质-染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

         

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