碱性蛋白酶活力的测定（福林—酚试剂法）
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一、实验目的
①学习测定蛋白酶活力的方法。
②掌握分光光度计 的原理和使用方法。
③学习绘制标淮曲线的方法。
二、实验原理
福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
三、实验器材
①分光光度计
②恒温水浴锅
②冷凝器
四、材料与试剂
①市售的碱性蛋白酶制剂。
②0.4mo/L碳酸钠：42.4gNa2CO3用蒸馏水溶解.定容到l000mL。
③4mo1/L三氯醋酸：65.6g三氯醋酸用蒸馏水溶解，定容到1000 mL。
④2%酪蛋白：2.0g酪蛋白加40mL蒸馏水，加3—5滴浓氨水，于沸水浴上溶解。
用pH11的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液定容到1000mL。
⑤pH11的硼酸钠-氢氧化钠缓冲溶液：0.1mol/LNaOH与0.05mol/LNa2B4O7等体积混合。
⑥福林—酚试剂：50g钨酸钠(Na2W04·2H20)，12.5g铂酸钠(Na2Mo04·2H20)，
350mL水，25mL 85%磷酸，50mL浓盐酸放入1000mL圆底烧瓶中，文火回流(保持微沸)10 h，撤下冷凝器，加150g硫酸铿(Li2O4)，25mL水，混匀加溴水约5mL脱色。直至金黄色为止，再微沸15min，驱除残溴，冷却，用4—5号耐酸细菌 漏斗过滤，定容到500mL，盛于洗干净干燥的棕色瓶中，使用时以1：2稀释。
五、操作方法
(1)样品处理
精确称取粉制酶制剂1.0g用PH 11的硼酸钠—氢氧化钠缓冲液溶解并定容到200ml,于40℃浸取30min，滤纸过滤，取2ml滤液用PH11的硼酸钠-氢氧化纳缓冲液定容到50mL。
(2)比色测定
取10mL离心管4支分别加入稀释筋液1.0mL。
平行试验3支 空白试验1支
①于40℃水浴预热2—3min。 ①于40℃水浴预热2—3min。
②加1.0mL 40℃预热的2%酪蛋 ②加2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸40℃保
白，于40℃反应10min。 温10min。
③加2.OmL 0.4mol/L三氯醋酸反 ③加l.0mL 2%的酪蛋白，反应15min
应15min过滤。 过滤。
④取过滤液1.0mL放入盛有5mL Na2C03溶液的试管中。
⑤加1.0mL l：2稀释的福林—酚试剂(此试剂应最后加入)于40℃水浴发色20 min。
⑥7220型分光光度计在680nm比色，比色皿厚1cm。
(3)比色常数(K)的求法
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 酪氨酸/ml | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
| H2 O/ml | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 |
| Na2 CO3 /ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 福林-酚/ml | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| OD680 |
将DL-酪氨酸于105℃烘2h，精确称取0.1000g，加少量0.2mol/L盐酸加热溶解，用蒸馏水定容到1000mL(每毫升含DL-酪氨酸100.0 µg)，取5支试管，按下表加样。
摇匀于40℃发色20min，以0号管为空白，在680nm进行比色。
以吸光度OD为纵坐标，以DL-酪氨酸含量(µg)为横坐标作一直线，可求出比色常数K—单位吸光度值相当DL-酪氨酸的µg数。
(4)计算
活力单位规定：在pH11，40℃，1min内产生1mg酪氨酸的酶量(g)为一个活力单位。
总活力(U/g)=K× ×OD×稀释倍数
式中 K—为比色常数，DL—酪氨酸µg/吸光度;
OD——吸光度;
稀释倍数——200´ 50/2;
4——酶活测定液的稀释倍数;
10——酶促反应时间，min。
六、思考题
1. 0.4mol/L碳酸钠、0.4mol/L三氯醋酸溶液的作用是什么?
2. 为什么要把反应条件控制在pH值为11、温度为40℃?
3. 稀释的酶溶液是否可以长期使用?为什么?
