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        —步基因破坏法

        相关实验：基因置换实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        实验材料
        质粒pFA6a-kanMX6酵母菌株7-1 BY4741
        试剂、试剂盒
        DNA 引物
        仪器、耗材
        SC-ura平板YPD 平板

        步骤

        第 1 天 将菌株7-1在 YPD 平板上划线，置 30°C培养。
        第 3 天 挑取一个丰满的菌株7-1的菌落，接种到5mlYPD培养液，置 30°C培养过夜。 第 4 天 用血球计数板测定5m l菌株7_1培养物的细胞密度（ 附录G ，使用标准血球计数板 进行酵母细胞计数)。在装有50ml Y P D 的锥形烧瓶中将细胞稀释至5X 106个细胞/ml， 置 30°C培养细胞到两次分裂（ 约 4h)。 按 照 “技术和方案1， 酵母的高效转化”收获细胞，用 约 >吵4 . V h n M X 的 PC R 扩增DNA进行转化，所提供的DNA母液是按照“技术和方案14, PCR介导基因 破坏法”制备的，使 用 pFA6a-kanMX6 作模板。制备的两个引物为 5,PEP4DEL TGGTCAGCGCCAACCAAGTTGCTGCAAAAGTCCACAAGGCCGGATCCCCGGGTrAAITAA 3,PEP4DEL ' AATCGTAAATAGAATAGTATTTACGCAAGAAGGCATCACCGAATTGAGCTCGTITAAAC 必须做一个不加D N A 的转化作为阴性对照，将每种转化液涂到Y P D 平板，置 30°C培 养 1 天。 第 5 天 把每一块平板影印复制到含有20(V g/m lG 418的 YPD 平 板 （ YPD+ G418)上。 第 7 天 挑 11个转化子，在 YPD+ G418平板上划单菌落，仅 使 用 3 个平板，每个平板可 划 出 3 或 4 个转化子，置 30°C培养2 天。 第 9 天 1 ) 从 11个 在 YPD+ G418平板上划线（ 自第7 天）的转化子中分别挑一个菌落，使用 “技术和方案1 5 , 酵母菌落PCR”检 测 基 因 是 否 已 经 破 坏 。须用菌株7-1作 对照。保留平板。使用以下四个引物扩增DNA: 5，PEP4 GGGAACAGAGTAAAGAAGTTTGGG 5，TEF GTTCTCACATCACATCCGAAC 3，TEF GGGCTAAATGTACGGGCGAC 3，PEP4 AGGATAGGGCGGAGAAGTAAGAAAAG 2 ) 在进行PC R 扩增的同时，准 备 1.0%琼脂糖凝胶。 电泳检测每个菌落的PC R 产物。加 3 4 琼脂糖凝胶上样缓冲液到每个PC R 样品 中，将反应物全部上样，包 括 DNA标准相对分子质量标记。野生型PEP4 基因将产生 一个约1.5k b 的条带，而 等 位 基 因 将 产 生 两 个 341b p 的 条 带 （5'端连 接点）和一个约l .Okb的 片 段 （3'端连接点）。 3 ) 将 3 个 如 # 转化子在YPD+ G418平板上划线，将 菌株7-1在 Y PD 平
        板上划线。每个平板划两个菌株，置 30°C培 养 3 天。 第 1 1 天 从 第 7 天 和第9 天的平板上挑取菌落，与 菌株7-1 —同分别点接于Y P D 平板上， 培养过夜。 第 1 2 天 按 照 “技术和方案9 , 羧 肽 酶 Y 的平板鉴定” ，用 A P E 蛋白酶平板检测法检测 YPD 平板上的菌落。注意辨别菌落之间的颜色差异

        来源：丁香实验

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