【原创】组织免疫共沉淀的实验方法

论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助

实验方法如下:

第一步：制备组织裂解物
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用 于后续实验。
或

1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解
2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。
3. 每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时
5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀 。
裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。

第二步：预纯化裂解物
使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。

主要步骤：
1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时
2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads， 4°C缓慢摇动10-30分钟
3. 14,000 x g 4°C离心10分钟
4. 取上清，弃沉淀
为提高蛋白回收率，可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次，所得上清和前面的合在一起
Note：要确保最大可能将正常血清（或无关Ig）从标本中去除。

第三步：免疫沉淀
1. 取10-500 μg细胞裂解物，加入推荐量的抗体：抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量，如果说明书没有推荐，也可以参考以下数据：.
o 多抗血清：1-5 μl
o 亲和纯化的多抗：1 μg
o 腹水（单抗）：0.2-1 μl
o 培养上清（单抗）：20 -100 μl

2. 4℃缓慢摇动孵育1h到过夜，取决于蛋白的量以及抗体的亲和力

3. 同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠：根据抗体类型选择合适的beads（参考附表2），如果IP抗体是IgM：不使用protein-A/G beads，直接使用Goat anti Mouse IgM beads。

4. 加入混匀的70-100ul protein-A/G beads，4℃缓慢摇动4h（根据具体实验优化孵育时间)

5. 2500rpm(约1000g) 4°C离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。

6. 用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。

7. 最后一次洗涤后，去除上清，加入25-50ul 2×电泳上样缓冲液，95-100°C煮沸5分钟（将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来）。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80°C保存。

Loading buffer是最强力的洗脱液，所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来，这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液（up to 1 M）从抗体上洗脱下来。

附1：免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂
裂解buffer中各种成分的推荐浓度范围
Salts: 0-1 M
Detergent, non-ionic: 0.1-2%
Detergent, ionic: 0.01-0.5%
Divalent cations: 0-10 mM
EDTA: 0-5 mM
pH: 6-9

1. 非变性裂解buffer：
适用于抗原类型：可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别
20 mM Tris HCl pH 8
137 mM NaCl
10% glycerol
1% Nonidet P-40 (NP-40)
2 mM EDTA
4°C 可保存6个月
使用前加入：Protease inhibitors
上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代

2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer
含有更强的变性剂，特别适用于核蛋白的提取。
50mM Tris HCl pH 8
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。

3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解buffer（Detergent-free soluble protein lysis buffer）：
一些可溶性蛋白不需要使用去污剂，只要使用该buffer配合机械性的破碎操作即可：如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作
含有以下成分的PBS：
5 mM EDTA
0.02 % Sodium Azide
4°C 可保存6个月
使用前加入：Protease inhibitors

4. 变性裂解buffer或不溶于变性剂的抗原提取buffer:
有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要使用变性裂解buffer，然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去污剂提取的蛋白。在该buffer中加入DNase1将有利于提取染色质蛋白
1% SDS
5 mM EDTA
室温可保存1周
使用前加入：Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml DNase1

5、其它所需试剂：
蛋白酶抑制剂Protease inhibitors ：推荐使用蛋白酶抑制剂cocktail，也可使用PMSF (50 ug/ml)和aprotinin (1 ug/ml).
无菌PBS pH 7.4
无菌PBS-BSA 1% (过滤处理)
TBST缓冲液
WB上样buffer