🔥 免疫共沉淀质谱

免疫共沉淀是一种用于从复杂混合物中富集或纯化特定蛋白质的技术，然后结合质谱可以鉴定特定蛋白的相互作用蛋白，本方法讲述从细胞裂解到质谱制样的步骤。

利用质谱技术强大的蛋白质定性能力，检测蛋白质相互作用组学。

对于悬浮细胞：

1, 将待裂解的细胞轻轻地转移至预冷的微量离心管中，用预冷的 PBS 洗涤细胞一次。

2, 离心弃去 PBS，然后加入预冷的裂解缓冲液（对于每 10⁷ 个细胞加入 1 ml）。

3, 在 4 ℃ 下以恒定速率混匀 5～20 min，使充分裂解。

4, 在 4 ℃ 下 14000 g 离心 10 min，吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中，然后弃去沉淀物。

对于贴壁细胞：

1, 弃去培养基，用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。

2, 去除 PBS，加入预冷的细胞裂解液，在冰上孵育 5 min。

3, 从培养皿上刮下细胞，并转移至 EP 管中。

4, 14000 g，4 °C 离心 10 min，然后将上清液转移到新的 EP 管中。

5, 预清洗裂解物：向 1 mL 裂解物中加入 50 μL 来自相同物种和同亚型的非目标抗体作为免疫沉淀抗体，在冰上孵育 1 h。

6, 4 °C, 5000 g 离心 10 min 弃去微珠沉淀物，保存上清液进行免疫沉淀。

7, 抗体孵育：向微量离心管中加入约 70～100 µL 的蛋白质 A 或 G，加入 10 µL 一抗 （需根据抗体浓度计算）。

8, 在 4 °C 下，翻转混合仪轻轻混匀抗体-微珠混合物，并孵育 1～4 小时。

9, 在 4 °C 下以 1000～3000 g 离心 2 分钟，然后弃去上清液。

10, 洗涤：加入 1 mL 裂解缓冲液上下颠倒重悬微珠，然后在 4 °C 下以 3000 g 离心 2 分钟。重复此洗涤步骤两次。

11, 加入 40 µL 蛋白上样缓冲液，95 °C 加热 5 min 以洗脱样品。

12, SDS-PAGE 电泳跑胶：选择合适浓度的胶，进行电泳分离。

13, 切下包括溴酚蓝在内的胶块，纯水清洗三次，用小刀片将胶块切成 1 mm × 1 mm 的小胶粒，装入洁净的 EP 管，胶粒可在 -80 °C 保存数月。

质谱制样

1, 胶粒脱色：1 ml 纯水清洗胶粒一次，移液枪去除上清。加入 1 ml 50% 乙腈的 25 mM 碳酸氢铵溶液，室温振荡 5 min 后去除上清，重复一次。

2, 胶粒脱水：加入 1 ml 纯乙腈吹打胶粒，胶粒会立马变白，室温振荡孵育 10 min 后去除乙腈，置于真空干燥仪 37 °C 10 min。

3, 还原：加入 1 ml 25 mM 碳酸氢铵配制的 50 mM DTT 溶液，56 °C 振荡孵育 1 h。

4, 烷基化：DTT 还原结束后，冷却至室温，迅速加入 1 ml 25 mM 碳酸氢铵配制的 20 mM 碘乙酰胺溶液，抽屉避光静置 45 min。

5, 重复步骤 1 和 2 清洗胶粒，用于胰酶消化样品。

6, 胰酶消化：用 200 μl 25 mM 碳酸氢铵配制 0.5 ug 的胰酶，加入干燥的胶粒中，冰上静置 10 min，待胶粒吸收酶液后，置于 37 °C 振荡消化约 4～10 h。

7, 吸取胶粒上清转移到新的 EP 管，并用 200 μl 的 50% 乙腈的 25 mM 碳酸氢铵溶液清洗胶粒两次，合并到 EP 管中，置于真空干燥仪直至烘干，烘干的样品可以在 -80 °C 保存数年。

注：也可使用磁珠通过磁性分离方法进行免疫沉淀实验。

a. 细胞裂解完成后，需要对蛋白质裂解产物进行预清洗。

b. 微珠的蛋白 A/G 包被要根据 IP 抗体的来源物种与血清型来选择。

c. 富集特定带标签的蛋白也可以使用标签抗体偶联的微珠。

d. 质谱样品制备一定要完成还原和烷基化。

e. 推荐用低吸附 EP 管进行实验。

f. 尽量避免接触塑料制品，实验中避免污染

A. 高背景：20000 g 离心去除裂解液中的不溶物，微珠预处理裂解物。

B. 质谱鉴定到的蛋白少：加入新鲜的蛋白酶抑制剂，加大样品的蛋白浓度。洗脱液 BCA 定量，蛋白浓度应大于 0.1 μg/μL。