超声破碎程序以及注意事项

将待处理菌液盛于50毫升小烧瓶,先置于冰浴中30分钟，并在超声仪加入一些冰袋（超声仪预冷30分中）。以直径1厘米内插式探头插入菌液中（探头表面最好光滑），最好进行间歇式超声处理，探头距杯底0.5厘米----1.0厘米处不可接触杯底，也不可接触杯壁以防将杯壁超碎。.设置开15秒 停45秒，12AM超10次左右。（如效果不佳如此反复以效果最佳定次数)（超声能量是100-350瓦，观察指标具体如下：

1. 被处理细菌悬液的透明度和温度（完毕后菌液变为澄清略显油状，或淡黄色均质溶液）。

2. 镜检。涂片革蓝结晶紫染色0.5分钟，染色后用水冲洗，然后在显微镜下观测细胞，并计数WGS染色看细菌。

3. 吸光度检测：A600处光的吸收值在超声有作用是应该下降。

4. 离心看菌体（白层）6000转，10分，4度。

通过以上四相判断超声效果

其它注意事项：

1. 防止能量太大，产热过盛，蛋白发生炭化，但变黑的原因还有含杂质、化学试剂作用等等

2. 起泡使蛋白溶液易溅出而且位于泡沫表面的蛋白易变性，影响最终得率。
防止方法：1.一定要将末端插入液面下较深部位，防止与空气物质接触，产生气泡；2.每次超声的菌液量要适中（有一最适菌液浓度）

3. 离心后沉淀再重复超声破碎一次，合并两次上清液处理后上柱。

4. 取超声前与加入溶菌酶前以及超后菌液与沉淀对照液做电泳。

5. 消除黏度（有核酸引起）可用DNAseI消化。

6. 超声破碎有一个最适合的菌液浓度（例如100mg/mL）。

7. 若效果不佳可预先加适度溶菌酶。

反复冻融：-70度反复冻溶或液氮反复冻溶

加入溶菌酶(100ug/ml-1mg/ml)后，最好用磁力搅拌器搅拌30分钟后，再超声。其作用原理打孔机制（胞壁酸）：细菌悬液由开始的乳浊状像牛奶加入溶菌酶后，菌液聚集有细小颗粒状物出现主要观察指标有（如果有效）黏度加大（染色体物质,需加DNAI或超声破碎）；pH值下降（用pH试纸检测）此酶的最佳作用pH>8.0，不断调节pH直到不在下降。注意第一溶菌酶的效力，第二浓度 第三pH>8.0。