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        鸡卵泡颗粒细胞分离、培养

        丁香园

        7574

        1.实验动物

        产蛋期母鸡(动物实验中心购买),普通饲料喂养,自由进食进饮;实验前禁食12h

        2.主要试剂及仪器

        EDTA-2Na购自国药集团化学试剂有限公司;
        双抗购自Hyclone公司;
        M199培养基、胎牛血清及Ⅱ型胶原酶均购自美国Gibico 公司;
        CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司

        3.实验步骤

        A. 翅下静脉注射2mL EDTA-2Na(W/V,2%)溶液处死母鸡,新洁尔灭消毒液浸泡消毒5min,打开腹腔,剪取整个卵巢,小心剥离卵泡(以8-15g为最佳),置于装有PBS缓冲液的无菌培养皿中;
        B. 用加有双抗的PBS缓冲液冲去血污,漂洗3次;将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS缓冲液的平皿中,剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网;
        C. 用手术刀在卵泡表面划一道1-2cm长的切口(动作要快),释放卵黄,用PBS缓冲液将剩余的卵黄液漂洗干净,剩下的卵泡膜即为:基膜和卵泡颗粒细胞层;
        D. 将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎,置于15mL离心管中,加4mL培养基,用1mL移液枪反复吹打1min,自然沉降5min,收集上清液备用;
        E. 向离心管内加入4mL 0.2%Ⅱ型胶原酶,重悬沉淀,置于37℃恒温水浴锅中消化30min,每5min震荡一次;
        F. 消化结束,加入4mL M199完全培养基(含10%血清)终止消化;用200目不锈钢筛过滤,收集滤液,1200rpm离心5min;
        G. 沉淀用M199洗2次,室温离心,1200rpm,5min;弃上清,加入M199完全培养基(含5%FBS及1%双抗)重悬后接种于6孔塑料培养皿,置于37℃、5%CO2培养箱内静置培养;12-24h首次换液,随后每天观察,2-3天换液一次,待细胞生长融合用于实验。

        鸡卵泡颗粒细胞分离、培养

        Fig 1.卵泡构造模式图

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