方案23.39 小脑颗粒细胞的培养

将 4~8 只新生鼠的小脑切成小立方块，放入 HBSS，在 37°C 条件下用胰蛋白酶消化 15 min。将细胞接种于涂有 L-多聚赖氨酸的培养皿或培养瓶。

1. 在无菌条件下切除小脑，放入 HBSS（含有 3 g/L BSA）。

2. 用解剖刀将脑组织切成约 0.5 mm³ 大小的立方体。

3. 将组织块移入 12 ml 试管，用 HBSS 洗 3 次。每次洗涤后让组织块沉到试管底部。

4. 加入 10 ml 用 HBSS 配制的 0.025 % 胰蛋白酶（用 HBSS 配制），在 37°C 条件下用水浴箱孵育 15 min。

5. 将胰蛋白酶消化的脑组织移入 50 ml 离心管，然后加入 20 ml 生长培养液，以终止胰蛋白酶的消化作用。

6. 通过用硅化的 Pasteur 吸管研磨使组织分散，直至获得单细胞悬液。

硅化 Pasteur 吸管：

(a)用超纯水将硅酮液稀释为 0.1%~1%；

(b)将吸管浸人硅酮液或用硅酮液冲洗吸管内面；

(c)放置 24 h 晾干或在 100°C 条件下放置几分钟使吸管变干；

(d)将吸管干热灭菌。

用 L-多聚赖氨酸处理培养皿：

(a)用超纯水溶解 L-多聚赖氨酸（10 mg/L）；

(b)将混合物过滤除菌；

(c)每个 35 mm Petri 培养皿内加入 1 ml L-多聚赖氨酸液；

(d)10~15 min 后吸出 L-多聚赖氨酸液，加入 1~15 ml 培养液；

(e)将培养皿在培养箱内放置 2 h 以上，至细胞接种。

7. 将盛有细胞悬液的离心管放 3~5 min，让小的组织团块沉到试管底。然后，用 Pasteur 吸管吸出组织团块。

8. 将单细胞悬液离心（200 g ，5 min ) 后，吸出上清液。

9. 用生长培养液混悬细胞团，然后接种细胞，每个培养皿的细胞密度为 2.5×10⁶~3.0×10⁶ 个。

10. 培养 2~4 d 后（两天后最佳），加入 5~10 μmol/L 阿糖胞苷，继续培养 24 h。

11. 用 DMEM （含有 30 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、24.5 mmol/L 氯化钾、100 mU/L 胰岛素（Sigma，Ⅰ-1882）、7  μmol/L 对氨基苯甲酸（Sigma，A -3659）、100  μg/ml 庆大霉素和 10 % 加热灭活的 FCS）换液。