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        自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的杀伤功能

        相关实验:自然杀伤细胞和淋巴因子激活杀伤细胞的杀伤功能实验

        最新修订时间:

        原理

        NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中,能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞,无需抗原或有丝分裂原刺激,亦不依赖抗体或补体,在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。
          
        LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下,获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功
        能,在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
          
        通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562(红白细胞白血病细胞)或LAK的靶细
        胞LiBr(黑色素瘤细胞),按一定细胞比例与效应细胞(NK或LAK)孵育4 小时,根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。

        材料与仪器

        步骤

        一、效应细胞的制备
          
        NK功能效应细胞可取静止的PBMC,或经不同细胞因子诱导的PBMC。
          
        LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或体液(癌性胸腹水)中纯
        化的淋巴细胞(1×106 /ml)在含有高剂量IL-2(200~1000 μ/ml)的10 %FCS RPMI1640 诱导2~5 天而成。
          
        二、杀伤试验
          
        主要有4 h 51Cr释放法和3H-TdR释放法,前者要求51Cr质量好,同位素半衰期
        较短,操作所需时间短;后者需要无菌操作,所需时间较长。
          
        1.  51Cr 4 小时释放试验
                 
        (1)收获处于对数生长期的靶细胞(K562,LiBr等)
        洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml
                          
        (2)取1×106细胞(0.5 ml),加Na251CrO4 100 μci,37 ℃孵育2~3 h,每15 min轻轻振摇一次
           
        (3)用10 %FCS RPMI1640洗涤3 次,每次800 rpm,5 min
             
        (4)重悬细胞浓度1×105 /ml
                           
        (5)96 孔V型或U型培养板中,每孔加100 μl(1×104细胞),每份3 个复孔

        (6)每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100 μl,1 %TritonX-100;自然释放组加100 μl完全培养基
                          
        (7)200 g 离心1 min,37 ℃、CO2孵箱 4 h,200 g 离心1 min
                          
        (8)每孔取出100 μl上清,γ计数仪上测定cpm值
          
        (9)计算

         
                  实验组cpm-自然释放cpm
        特异性杀伤率(%)=─────────────
                  最大释放cpm-自然释放cpm
          
        2.  3H-TdR释放试验
                
        (1)收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等)洗涤后
        调整细胞浓度为2×106 /ml,加3H-TdR 20 μci
                               
        (2)37 ℃孵育2~3 h
                      
        (3)用10 %FCS RPMI1640洗涤3 次,每次800 rpm,5 min 调整细胞浓度为1×105 /ml
                
        (4)96 孔U型或平底培养板中,每孔加100 μl(1×104细胞),每份3个复孔
                            
        (5)每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加100 μl 1%TritonX-100,自然释放组加100 μl完全培养基
                           
        (6)CO2孵箱培养18~24 h
                            
        (7)每孔吸出100 μl上清,加入胰蛋白酶(终浓度0.15 %)和DNA酶(终浓度为0.0125 %)
                            
        (8)继续孵育30 min
                            
        (9)用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上
                           
        (10)干燥后,移入液闪瓶中,加入1 ml闪烁液,β液闪仪中测cpm值

        (11)计算
         
                    实验组cpm
        特异性释放率(%)=(1- ────── )×100%
                    对照组cpm

        注意事项

        1.  每次试验最好取3~4 个不同效应细胞/靶细胞比例,常用效靶比例为100∶1,50∶1,25∶1,12.5∶1。
          
        2.  诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
          
        3.  避免同位素污染。
          
        4.  根据实验需要,可采用纯化的NK细胞作为效应细胞,用Percoll不连续密度梯度离
        心纯化NK细胞。
         
        (1)1个溶解单位(Lytic unit,LU)为一定效应细胞30 %溶解(杀伤)5×103靶细胞(K562)的水平。

        (2)如需进一步纯化LGL,可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞(T细胞),因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体(ER)。具体方法是将Percoll分离的位于第2梯度的细胞洗涤后调整细胞浓度为5×106 /ml,移入试管,加入2 mlFCS和2 ml 1×108 /ml SRBC,100 g离心5 min,29 ℃孵育1 h,轻轻重悬细胞,叠加于3 ml Ficoll上,400 g室温下离心30 min界面不形成花环的细胞即为LGL,纯度可>90%。
          
        (3)在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时,如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞,
        可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞,而不用NH4Cl方法,因为后者可降低NK功能。
          
        (4)在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄,不同小鼠系NK活性有明显的差别

         
        (5)3周以内或超过3个月以上小鼠的NK水平一般很低。

        来源:丁香实验

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