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        PBMC 细胞的精确计数和活性分析

        北京达科为生物

        22412

        一、PBMC细胞计数的现状

        1. 目前,绝大多数的科研工作者仍在使用血球计数板 在显微镜下进行手工计数 PBMCs;

        2. 但是显微镜下由于白细胞和红细胞大小非常接近, 不能完全区分白细胞和红细胞;

        3. 通过红细胞的双凹形形态鉴别红细胞,需要经验丰 富的操作者,且不停地调焦来鉴别;可想而知要把每个 红细胞鉴别出来,要耗费多长的时间,需要多强的工作量。

        PBMC样本的差异性大 由于个体的差异(如正常人和病人)和人工分离提取的差异,红细胞和血小板污染的程度差异性非 常大,因此我们经常看到分离后的PBMC样本千差万别(见下图),这也大大增加了在同一条件下, 简单快速准确计数PBMC的难度和检测 PBMC活性的难度。

        二、PBMC精确计数或活力分析的重要性 PBMC(外周血单个核细胞)是免疫学功能研究中最常用的细胞模型,如细胞增殖、细胞毒性、细 胞因子分泌等。

        如在癌症免疫治疗领域中,需从病人全血中分离出 PBMC,分离的PBMC进一步扩增或进行不同的 功能检测。激活扩增后的细胞再回输到病人体内进行细胞治疗。在整个流程中,从分离到检测,到 培养,到回输等过程,细胞浓度和细胞活力都是必须监测的参数。

        密度梯度分离液是从外周血、骨髓,及脐血分离单个核细胞最常用的方法。但是不可避免的,分离 后的细胞中,会有残存的红细胞及血小板混合在单个核细胞中。残存的红细胞和血小板的多少,个体的差异,以及分离的效果相关;但是不管分离的技术多高超,经验多丰富,都不可避免会存在红细胞和血小板的污染。

        PBMC实验的特征:

        1. 随着时间的延长,细胞质量下降;

        2. 临床试验相关的样品量很大;

        3. 细胞样品不纯,分离之路依赖病人样本和操作者

        计数 PBMC以及精确分析PBMC活力:

        1. 使用血球计数板在显微镜下进行手工计数 PBMC,即耗时耗人力,更不能达到精确计数的目的。

        2. 通过明场的常规细胞计数仪同样不能区分红细胞,不能达到精确计数PBMC和精确活力分析的 目的。

        3. 迫切需要快速、简便、精确计数PBMC的工具替代人工计数。Nexcelom公司走在了市场领先的 位置,在常规明场的细胞计数仪基础上,开发出了双荧光细胞活力分析仪,可通过 AOPI染料进 行 PBMC的快速精确计数和活力分析。

        参考文献

        1. PreliminaryReport:EvaluationofStorageConditionsandCryococktailsduringPeripheralBlood MononuclearCellCryopreservation",L.M.Cosentino,W.Corwin,J.MBaust,N.Diaz-Mayoral,H.Cooley,W. Shao,R.Van Buskirk,and J.GBaust,CellPreservationTechnology,Volume5Number4,2007
        2. "ViabilityandFunctionalActivityofCryopreservedMononuclearCells",A.Weinberg,L.Zhang,D.Brown,A.

        Brice,B.Polsky,M.S.Hirsch,S.Owens,and K.LambClincaland DiagnosticLaboratoryImmunology,July,

        2000,P714-716

        3. "Celllossandrecovery inumbilicalcordbloodprocessing:acomparisonofpostthawandpostwashsamples", V.Laroche,D.H.McKenna,G.Moroff,T.Schierman,D.Kadidlo,andJ.McCullough,Transfusion,Vol.,45, Dec.2005.
        4. "ViabilityandRecoveryofPeripheralBloodMononuclearCellsCryopreservedforup to12Yearsina MulticenterStudy",C.A.Kleeberger,R.H.Lyles,J.B.Margolick,C.R.Rinaldo,J.P.Phair,andJ.V.Giorgi, ClinccalandDiagnosticlaboratoryImmunology,Vol.6,No.1,Jan.1999.

        三、如何精确计数PBMC和活力分析检测

        通过AOPI染料进行双荧光计数和活力分析,是可以排除红细胞、血小板、细胞碎片等污染的精确 计数方法。O(吖啶橙)和 PI(碘化丙啶)是可对 DNA染色的细胞核染色试剂。其中 AO可以通过完整的细 胞膜,嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核,呈现绿色荧光;PI只能通过不完整的细胞膜,即死细胞的细胞膜,嵌入所有死细胞的细胞核,呈现红色荧光。

        活死单个核细胞可呈现荧光信号。而成熟的 红细胞及血小板,因为没有细胞核,不能被 AO/PI 染色,因此可以完全被排除在外不被 计数。

        通过 AOPI染料进行双荧光计数和活力分析,可以精确计数分离后的 PBMC以及活力分析,亦可进 行全血中的PBMC。

        四、Cellometer细胞计数和活力分析仪器型号选择

        1. 双荧光计数和活力分析是 PBMC计数的最佳选择方法。

        三款仪器型号可选:AUTO2000/K2/ VISIONCBA,可精确、快速、简便进行 PBMC计数和活力分析。

        2. 明场的自动细胞计数仪进行PBMC计数,可通过台盼蓝排斥法进行 PBMC的活力检测。

        虽然也能达到自动、快速的目的,但是仍无法有效的排除红细胞的干扰,达到精确计数的目的。 台盼蓝排斥法检测细胞死活,是通过台盼蓝这个细胞活性染料,其不能透过活细胞正常完整的 细胞膜,故活细胞不着色,但死亡细胞的细胞膜通透性增加,可使染料通过细胞膜进入细胞内, 使死细胞着色呈蓝色。

        是最常用的检测细胞活率的方法。 但是台盼蓝排斥法并不能精确计数活死细胞,原因是细胞膜通透性不一样,进入细胞内的染料 差异也很大,所以经常会出现很难判定是死细胞还是活细胞。

        如果对PBMC计数的准确性要求不是很高,但是需要快速、自动计数,而且对实验的一致性和 重复性的要求高,可选择以下三款计数仪:AUTO1000/MINI/AUTO T4。

        参考文献

        1. Chan, L.L.,Wilkinson,A.R., Paradis,B.D.andLai,N.(2012b)RapidImage-basedCytometryforComparison ofFluorescentViabilityStainingMethods.JournalofFluorescence22,1301-1311.
        2. Almeida,C.-A.M.,Roberts,S.G.,Laird,R.,McKinnon,E.,Ahmed,I.,Pfafferott,K.,Turley,J.,Keane,N.M., Lucas,A.,Rushton,B.,Chopra,A.,Mallal,S.andJohn,M.(2009)Automationofthe ELISpotassayfor
        high-throughputdetectionofantigen-specificT-cellresponses.JournalofImmunologicalMethods344,1-5.

        3. Constantino,B.T.and Cogionis,B.(2000)NucleatedRBCs-Significanceinthe PeripheralBloodFilm.
        LaboratoryMedicine31,223-229.

        4. Laroche,V.,McKenna,D.H.,Moroff,G.,Schierman,T.,Kadidlo,D.andMcCullough,J.(2005)Celllossand recoveryinumbilicalcordbloodprocessing:acomparisonofpostthawand postwashsamples.Transfusion
        45,1909-1916.

        5. Sigfusson,A.and Souhami,R.(1984)The EffectsofErythrocyteContaminationonPokeweedMitogen
        InducedImmunoglobulin-SynthesisinMan.JournalofImmunologicalMethods72,167-170.

        6. Szabo,S.E.,Monroe,S.L.,Fiorino,S.,Bitzan,J.andLoper,K.(2004)EvaluationofanAutomated Instrument forViabilityand ConcentrationMeasurementsofCryopreservedHematopoieticCells.Laboratory Hematology10,109-111.

        详细信息请咨询:
        达科为生物技术有限公司

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