人PBMC中B细胞的流式分选

步骤如下：

1、将静脉血20ｍl用ACD抗凝剂以容积比血：抗凝剂＝9：1抗凝处理。

2、按血：分离液＝1：2注入淋巴细胞分离液上层，400g 20℃离心30分钟。

3、交接层重浮于4倍体积的RPMI1640并通过离心法200g，10min洗三次。

4、获得细胞可做分选或其他实验。

建议：

1、实验中用肝素方法抗凝，效果不好，因为肝素抗凝后交接层混浊，洗涤后没有细胞。推荐使用ACD抗凝剂，效果very good。

2、分层时的离心温度只能在20－25℃，过高细胞容易死亡或破坏，过低分层效果不好。

3、不能使用角离心机。

必备的比如流式分选盒，一抗，二抗，部分需要裂解液

分选步骤:

1. 在每个 2 mL EP 管或流式检测管中加入 100 μl 全血。

2. 按照抗体说明书中指定条件加入抗体后，轻轻混匀。

3. 避光室温孵育 15-30 min。

4. 裂解红细胞之前，应使裂解液平衡至室温。

5. 将待裂解全血轻轻混匀后，每 100 μl 全血加入适量裂解液立即在涡旋仪上震荡 1 s。

6. 室温下避光裂解 10 min 左右。

7. 加入 1xPBS至2 ml终止裂解。

8. 室温下 300-400 g 离心 5 min，弃红色上清。

9. 加入 2 ml PBS 颠倒混匀后，室温下 300-400 g 离心 5 min，弃上清。

10. 加入 200 μl PBS 混匀后，尽快上机检测。

流式细胞术的基本流程如下：

细胞样品的制备：从外周血、脐带血、骨髓、脾、淋巴结等组织中分离出PBMC，接着用荧光素检测细胞数量，使得每次染色实验含有相同数量的细胞。

细胞的染色：将需要分离的细胞表面的特定抗原与荧光素结合，以便后续光学信号检测和排序。一般会用到标记有FITC、PE、APC、PE-Cy7等荧光素的抗体。

流式细胞术检测：将染有荧光素的细胞样品通过流式细胞仪，由激光束激发荧光素，荧光素发出的荧光信号通过光学透镜放大并分析，最后被分类、计数和分选。

分选：将荧光素染色的细胞根据染色的强度、颜色等特征进行分类，可使用荧光素激活的单元格分选器（FACS）将细胞分离和分选。最终得到分选的B细胞。

对于人PBMC中B细胞的流式分选，一些必备试剂包括：

PBMC样本

标记有FITC的B细胞表面特异性抗体（如CD19抗体）

荧光素激活的单元格分选器（FACS）

细胞培养基

预冷的离心管和离心机

磷酸盐缓冲液（PBS）

血清和抗生素（可选）

具体流程如下：

用PBS洗涤PBMC，离心。

加入标记有FITC的B细胞表面特异性抗体，孵育后洗涤。

用细胞培养基悬浮洗涤过的PBMC，并将其通过FACS进行分选。将标记为CD19/FITC阳性的细胞单独收集。

用细胞培养基培养分选出的B细胞。

需要注意的是，在操作前要保证实验操作台、仪器和试剂都是无菌的，并保持洁净卫生，以避免潜在的污染。