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        蛋白质的浓度测定

        互联网

        9717

        检查试管是否干燥、洁净,若否,则将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。

        1.标准曲线的制作


        取普通清洁试管7支,标号,1号管为空白,2~7管用微量注射器分别加1.0mg/mL的牛血清白蛋白(即标准蛋白质)溶液10,20,40,60,80,100mL。各管均用0.015mol/L PBS缓冲液补充到100mL(即0.1mL),详见表6-1。混匀待用。


        表13-1标准曲线的制作
        管号
        标准蛋白质(mL)
        缓冲液(mL)
        总体积(mL)
        1
        0
        100
        100
        2
        10
        90
        100
        3
        20
        80
        100
        4
        40
        60
        100
        5
        60
        40
        100
        6
        80
        20
        100
        7
        100
        0
        100

        2.将待测蛋白配成合适浓度


        另取3支清洁试管,编号8、9、10,用微量注射器按表6-2操作,将待测蛋白配成系列浓度。

        表13-2待测蛋白的稀释


        管号
        待测蛋白质(mL)
        缓冲液(mL)
        总体积(mL)
        稀释倍数
        8
        20
        80
        100
        5
        9
        40
        60
        100
        2.5
        10
        60
        40
        100
        1.67

        3.加入G250试剂


        各试管充分混匀后,用取样器分别加入5.0mL考马斯亮兰G250试剂,每加完一管,立即混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。

        4.比色


        各管室温静置2~5min后,在分光光度计上测定595nm处的光吸收值A 595 ,空白对照为第1号试管,标准和待测蛋白样同时比色。
        注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),只能使用玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇润洗,洗去颜色。

        5.制作标准曲线


        以标准蛋白质浓度(mg/mL)为横座标、吸光度值A 595 为纵座标作图,即得到一条标准曲线。

        6.根据标准曲线计算待测蛋白浓度


        在标准曲线上,根据测出的待测样品的A 595 值,查出试管中蛋白质浓度,再按照计算公式:
        待测蛋白质的浓度(mg/mL)=查出的浓度×稀释倍数

        计算出待测蛋白浓度。如样品稀释合理且操作得当,待测蛋白的三个数值应具有同一性,取其平均值作为待测蛋白浓度。如某一光吸收值落在标准曲线线性范围外,舍弃该点。

         
        计算
        管号
        标准蛋白质(mL )
        缓冲液(mL )
        G-250试剂(mL)
        每管中的蛋白质浓度(mg/mL)
        光吸收值(A 595 )
        1
        0
        100
        5
        0
        2
        10
        90
        5
        0.1
        3
        20
        80
        5
        0.2
        4
        40
        60
        5
        0.4
        5
        60
        40
        5
        0.6
        6
        80
        20
        5
        0.8
        7
        100
        0
        5
        1.0
        管号
        待测蛋白质(mL )
        缓冲液(mL )
        G250试剂(mL)
        A 595
        查出的浓度(mg/mL)
        稀释倍数
        待测蛋白质浓度(mg/mL)
        待测蛋白
        8
        20
        80
        5
        5

        9
        40
        60
        5
        2.5

        10
        60
        40
        5
        1.67

        结果:待测蛋白质的浓度为: mg/mL
        (责任编辑:大汉昆仑王)

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