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        琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA

        互联网

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        【实验目的】

        通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理与方法。

        【实验原理】

        琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖,是由D型和L型半乳糖以α-1,3和β-1,4糖苷键相连形成的线状高聚物(如下图所示)。琼脂糖遇冷水膨胀,溶于热水成溶胶,冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的凝胶。

        琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一,这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径,在不同的装置中进行电泳,如果有必要,还能够从凝胶中回收DNA谱带。

        琼脂糖凝胶的分离范围较广,选择不同凝胶浓度和装置,从50个碱基对到几兆不同长度的DNA都可以实现分离。使用电场强度和电泳方向恒定的水平板琼脂糖凝胶电泳的方法,可以很好的分离长度在50-20,000 bp 的DNA片段。

        DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如DNA分子的大小;琼脂糖的浓度;所加电压等等。DNA片段越长,泳动速度越慢,而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性DNA片段,在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同,DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

        用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后,凝胶中的DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNA。

        【实验材料】

        1. 实验器材

        水平板电泳槽;灌胶模具及梳齿;电泳仪;55℃水浴;沸水浴;微量移液器

        2.实验试剂

        (1)DNA样品;DNA标准分子量标记物;琼脂糖;1x电泳缓冲液TBE;6x样品缓冲液

        (2)溴化乙锭:水中加入溴化乙啶,搅拌数小时至溶解。将配好的10 mg/ml溴化乙啶溶液装在棕色瓶中,室温保存,使用时稀释至0.5μg/ml。

        【实验操作】

        1. 照厂家说明准备好灌胶模具,置于水平面上(实验操作示意图如下)。

        2. 配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶,加入100ml TBE缓冲液,称取1克琼脂糖加入缓冲液中,沸水浴加热至完全溶解,然后在55℃水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿,将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度3~5mm,避免气泡产生。

        3. 室温放置30~45分钟,待凝胶完全凝固后,按照厂家说明将凝胶放入水平板电泳槽。

        4. 在电泳槽中加入电泳缓冲液,电泳缓冲液没过胶面1mm,拔下梳齿形成样品池。

        5. 取样品与6X样品缓冲液按照比例混合后,用微量移液器缓慢加入样品池中。

        6. 盖上电泳槽并且通电,注意电源正负极,确保样品向阳极移动。恒压1-5V/cm(按照两极之间距离计算),至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端1cm时,切断电源。

        7. 从电泳槽中取出凝胶,将凝胶置于0.5ug/ml溴化乙啶水溶液中,室温下振摇染色30~45分钟。

        8. 回收染色液,自来水冲洗凝胶后,于紫外灯下观察。

        【注意事项】

        1. 溴化乙啶是一种强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。

        2. 紫外线对人体,尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射,必须确保紫外线光源受到遮蔽。

        【思考】

        影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?

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