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        克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定

        最新修订时间:

        原理

        已转化的重组载体的细菌细胞或 λ 噬菌体颗粒可通过直接从培养皿上挑取菌落或噬菌斑获得,然后直接加入到 PCR 混合液中,这时 PCR 混合液中含有除了未加热稳定 DNA 聚合酶外的所有试剂,其中引物与所要鉴定的已克隆 DNA 片段的侧翼序列互补。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液与溶液

        10X 扩增缓冲液

        4 种 dNTP 贮存液(20 mmol/L,pH 8.0)

        Tris-Cl ( 10 mmol/L,pH 7.6)

        2. 酶与缓冲液

        热稳定 DNA 聚合酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶

        4. 核苷酸与寡核苷酸

        正义和反向引物(20 μmol/L) 溶于水中(20 pmol/μl)

        DNA 模板

        5. 特殊设备

        自动微量移液器的屏蔽型枪头

        沸水浴

        离心管

        正向排液式移液器

        PCR 仪

        二、方法

        筛选单个克隆的细菌菌落或 λ 噬菌斑

        1. 对所要筛选的细菌菌落或 λ 噬菌斑进行计数。制备适量的主混合液,每个所要分析的菌落或噬菌斑需要 25 μl 的主混合液,以此主混合液作为模板 DNA,再加入以下试剂,使总体积为 1 ml:

        10X 扩增缓冲液                     100 μl

        20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液  50 μl

        正向引物                               1 nmol

        反向引物                               1 nmol

        H2O 补足至                           1 ml

        2. 从上述主混合液中取 25 μl 至一支扩增离心管(根据实验需要可设几个扩增管 )。

        3. 用灭菌的 20 μl 枪头(不用牙签)挑取一个个的细菌菌落或 λ 噬菌斑,迅速地使挑取物溶在 25 μl 主混合液中。

        4. 盖上离心管的盖子,细菌菌落在沸水上温育 10 min,λ 噬菌体在沸水中温育 2 min。

        5. 在样品管主混合液于沸水上温育的同时,将 Tag 聚合酶用 10 mmol/L Tris ( pH 7.6)稀释至 1 单位/μl;再将这种稀释酶液在冰浴上保存备用。

        6. 将步骤 4 的样品冷却至室温,离心数秒钟,然后每一管加入 1 μl 稀释的 Taq DNA 聚合酶。

        7. 设置两支对照管。在一支对照管中加入除了模板 DNA 的所有上述试剂;在另一支对照管设置呈阳性对照管,即加入已分析证实呈阳性的重组 λ 噬菌斑或菌落裂解液作为模板 DNA。阳性对照管的扩增片段应较实验管的扩增片段更大些为佳。这种较大的阳性对照片段的成功扩增,说明这种稳定 DNA 聚合酶具有扩增多大长度片段的能力。

        8. 如果 PCR 仪没有配备加热盖,在反应混合液的上层应加一滴矿物油(约 50 μl )。将反应管放置 PCR 仪上。典型的程序有变性、复性和聚合(延伸反应);相应的循环条件与温度列表如下:

        克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定

        9. 抽取每种扩增样品 5~10 μl,用琼脂凝胶电泳来分析扩增结果,用 DNA marker 来判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭) 或 SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

        这种技术能够适用于在 96 孔微量滴定板上设计 PCR 进行大量的细菌菌落或 M13 噬菌斑的筛选(Trower 1996)。

        克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定
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        来源:丁香实验

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