RayBiotech定量芯片操作与技巧

1、实验材料及试剂

1.1 试剂盒包含内容

1.2 所需除试剂盒以外的材料及仪器

摇床

塑料保鲜膜

铝箔纸

双蒸馏水

Genepix荧光扫描仪

2、实验步骤

2.1 玻片芯片的完全干燥

将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

2.2 标准品的配置

2.2.1 细胞因子标准品梯度稀释图示

2.2.2 添加500μl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为Std 1。

2.2.3 分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。

2.2.4 抽取100μl的Std 1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std 2中抽取100μl加入到Std 3中，如此梯度稀释至Std7。

2.2.5 抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。

注：因为每种细胞因子的起始浓度是不同的，所以Std1 到Std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的。

2.3.1 每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30min，封闭定量抗体芯片。

2.3.2 抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育 （用封闭液 2倍稀释血清样本）

2.3.3 清洗

抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl 的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。

抽去每个孔中的1×洗液I，加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl 的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。

2.3.4 检测抗体混合物的孵育

离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。

2.3.5 清洗

抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl 的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl 的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液。

2.3.6 Cy3-链霉亲和素的孵育

离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

2.3.7 清洗

抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl 的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液。

2.3.8 荧光检测

1）将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面

2）将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液I，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液I，添加约30ml的1×洗液II，在室温摇床上震荡5min。

3）去除玻片的残留洗液

4）将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min；

5）采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号， 采用Cy3或者绿色通道（激发频率=532nm）

2.3.9 采用RayBiotech 配套的数据分析软件来进行数据分析。

3、实验注意事项

3.1 玻片的操作

3.1.1 不能触摸玻片的表面，因为玻片芯片非常灵敏，只能接触玻片的边缘；

3.1.2 操作实验时候，请戴上橡胶手套（不掉粉末），以免污染试剂和玻片；

3.1.3 避免打碎玻片

3.1.4 保持实验操作环境整洁；

3.2 孵育

3.2.1 样品和试剂孵育过程中，保证完全覆盖住玻片，且不能使玻片干燥

3.2.2 孵育过程中避免产生气泡

3.2.3 孵育过程和清洗过程保持在摇床上轻摇

3.2.4 在孵育过程中，用密封条将玻片芯片封闭，尤其是当孵育时间超过2个小时，或者样品、试剂的体积小于70μl的时候。

3.2.5 避免附近孔的交叉污染，邻近孔的液体避免溢出污染。