RayBiotech膜芯片操作与技巧

一、 试剂及材料（试剂盒包含内容）

1. 膜芯片---（RayBio®Human Cytokine Antibody Array membranes ，2/4/8张膜）

2. 生物素标记抗体---（Biotin-Conjugated Anti-Cytokines， 1/2/4 管， 每2张膜配1个管）

3. 1000×HRP-链霉亲和素---（HRP-Conjugated Streptavidin，1管）

4. 1X封闭缓冲液---（Blocking Buffer，2/4张膜配25 ml，8张膜配50 ml）

5. 20X的洗液I ---（20X Wash Buffer I，2/4张膜配10 ml，8张膜配20 ml）

6. 20X 的洗液II---（20X Wash Buffer II，2/4张膜配10 ml，8张膜配20 ml）

7. 2X细胞裂解液---（2X Cell Lysis Buffer，2/4张膜配10 ml，8张膜配20 ml）

8. 检测缓冲液C---（Detection Buffer C， 2/4张膜配1.5 ml，8张膜配2.5 ml）

9. 检测缓冲液D---（Detection Buffer D， 2/4张膜配1.5 ml，8张膜配2.5 ml）
10. 8孔孵育板---（Eight-Well Tray， 每个试剂盒配1个）

11. 操作手册

二、所需的材料及仪器

1. 摇床

2. 塑料保鲜膜

3. 双蒸馏水

4. 胶片及胶片显影机或者化学发光成像仪

三、操作程序

（2）如果必须使用含有血清的条件培养基，我们强烈建议使用完全培养基作为对照，因为血清中含有一定量的细胞因子。

（3）对于细胞和组织裂解液，我们推荐使用RayBio®细胞裂解液从细胞或者组织中提取蛋白（采用均质机）。用去离子水稀释2×细胞裂解液（我们推荐使用裂解液前添加蛋白酶抑制剂），提取蛋白后，离心样品取上清，检测蛋白浓度。

（4）我们推荐使用：1 ml的条件培养基（未稀释的），或者1 ml的2-5倍稀释的血清或者血浆，或者200-250 µg总蛋白的细胞和组织裂解液，裂解液至少用1×封闭液稀释10倍。

注：样品的量取决于细胞因子的量，如果信号太弱，就使用更多量的样品，如果信号太强，样品可进一步稀释，如果背景太高，也要进一步稀释样品。

2. 膜芯片的操作

（1）用镊子来进行膜的操作，用镊子夹住膜的边缘或者用镊子托起膜，避免夹在膜上有抗体的地方，膜比较脆，容易夹破，操作过程要保持轻柔。

（2）试验整个过程中膜芯片不能干燥。

（3）避免用手、枪头、或者任何尖锐的工具接触到膜。

3. 膜芯片的孵育注意事项

（1）样品或者试剂要将膜全部覆盖，孵育过程中要将孵育盒的盖子盖上，可以使用塑料薄膜包住孵育盒，避免灰尘和样品的蒸发。

（2） 加样和孵育过程中避免气泡。

（3）孵育过程和清洗过程保持在摇床上轻摇。

（4） 封闭、样品孵育、生物素标记抗体孵育、HRP-链霉亲和素孵育的步骤可以4℃孵育过夜，但是请务必封闭芯片非常严密，以免液体蒸发。

四、检测程序

1. 封闭和孵育

（1 ） 膜芯片带有“-”标志的面是印制有抗体的面，这个面朝上。当同时操作多个膜的时候，可在膜的边缘用圆珠笔标记数字，以便分辨避免混乱。

（2）在孵育板中每个孔加入2 ml的1× 封闭缓冲液，用镊子拖着膜或者夹着膜的边缘将膜缓慢浸没到封闭缓冲液中，有标志的面朝上，避免气泡产生，盖上孵育板的盖子，室温振荡孵育30 min。

（3）用抽液泵抽去每个孔的封闭液后，每张膜芯片加入1 ml样品（或者1×封闭液稀释好的样品），盖上盖子，包上塑料薄膜，室温振荡孵育1-2小时（此步也可4℃过夜孵育）。

（4）抽去每个孔中的样品，每孔加入2ml的1×洗液I清洗3次，每次5 min，室温摇床震荡，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。

注：避免相邻孔中的液体流动产生交叉污染。

（5）抽取每个孔中的1×洗液I，每孔加入2 ml的1×洗液II清洗2次，每次5 min，室温摇床震荡，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。

（6 ） 配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，加入100 µl的1×封闭液，混合均匀,再将管中所有的溶液加入到2 ml的1×封闭液中。

（7） 每个芯片上加入1 ml稀释好的生物素标记抗体，盖上盖子，包上塑料薄膜，室温振荡孵育1-2小时。

（8 ）清洗， 同3和4。

（9 ） 每张膜加入2 ml的1000倍稀释的HRP-链霉亲和素 （快速离心后，取2 µl的HRP-链霉亲和素与998 µl的l×封闭液混合），盖上盖子，包上塑料薄膜，室温振荡孵育2小时（此步也可4℃过夜孵育）。

（10）清洗，同步骤3 和4。

2. 检测

在整个检测过程中膜不能干燥，且检测过程在40 min内完成.

（1）将500 µl检测试剂C和500 µl检测试剂D（用于2张膜的检测）加入一支离心管中,混合均匀。将膜芯片从洗液II中捞出，夹在滤纸中去掉多余洗液后，转移到一个干净的孵育盒中，标记面朝上，每张膜加入500 µl检测混合液，室温振荡混合2 min，避免产生气泡。

（2）用镊子将膜从检测液中捞出，轻轻放在一张塑料片上，带有“-”标记在左上角，缓慢盖上另一张塑料片，驱赶气泡，避免压膜和反复摩擦，操作过程要尽快完成。

（3） 膜芯片的信号可用化学发光成像系统或显影仪器。

（4）化学发光成像仪可设置30 s、1 min、3 min、5 min连续拍照。

（5）如果使用胶片曝光，我们推荐使用Kodak X-Omat®AR胶片，x-ray胶片连续曝光。膜曝光40s，然后根据信号强度再次曝光，如果信号太强（背景很高），减少曝光时间（例如5-30秒），如果信号太弱，增加曝光时间（例如5-20min或者过夜）。