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        碱性磷酸酶(AKP)米氏常数(km)的测定

        互联网

        18411

        原理:

        当环境的温度、pH和酶浓度等条件一定时,酶促反应的初速度(V)随底物浓度[S]增高而加快,直到达到一个极限,即最大反应速度(V)。底物浓度与酶反应初速度的这种关系,米一曼(Michaelis—Menten)氏推导出如下公式,称为米—曼氏方程式:

        式中Km称为米式常数。Km是反应速度等于最大反应速度一半(v=V/2)时底物的浓度。Km是酶的特征性常数。测定Km是研究酶动力学的一种主要方法。林一贝(Lineweaver—Burk)氏根据米—曼氏方程式又推导如下方程式:

        以不同的底物浓度1/[S]为横坐标1/v为纵坐标,按直线回归方程计算,作图,并向纵轴方向延长,此线在横轴上截距为1/Km的负值。

        本实验以碱性磷酸酶为例,选择不同浓度的磷酸苯二钠为其底物,磷酸苯二钠被AKP水解后,生成酚和磷酸,酚在碱性溶液中与4—氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物,根据红色的深浅可测出酶活力高低,其反应式如下

        仪器 :

        中号试管 18支 恒温水浴

        刻度移液管 8支 721分光光度计

        比色杯

        试剂 :

        1.底物液(10mmol/l,磷酸苯二钠)

        称磷酸苯二钠(C 6 H 5 Na 2 PO 4 ·2H 2 O) 2.54克或磷酸苯二钠(无结晶水)2.18克,用煮沸冷却蒸馏水溶解并稀释至1000ml,加4ml氯仿防腐,棕色瓶4℃保存,一周内使用。

        2.缓冲液(0.1mol/L磷酸盐缓冲液,pHl0.0)

        无水碳酸钠6.36克及磷酸氢钠3.36克,溶于蒸馏水800ml,再加蒸馏水定量至1000ml。

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