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        PCR技术操作程序与优化方法

        相关方法:PCR反应程序

        互联网

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        典型的PCR操作

        在此处仅列出—般PCR操作过程,具体影响因素的优化将在本章第二节讨论,每一个具体操作前都需进行必要的优化。

        一、 试剂

        (1)引物根据待扩增DNA不同,引物亦不同,引物的设计见本章第三节。

        (2)耐热DNA聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的,能耐受高温(93—100c),不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第4节。 Perkin—E1mer—cetus公司、N、F、Bio1ab、PharMacia公司、国内华美公司、复旦.大学和中国医学科学院友谊公司等均有商品供应。

        (3)10x PCR缓冲液: 500mm01/L KCl; 100mmol/L Tris一HCl(pH8.4, 20c),150mmol/L MgCl2, lmg/m1明胶。

        (4)5mmo1/L dNTP贮备液:将dATP,dCTP,dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并,加3m1灭菌去离子水溶解,用NaoH调pH至中性,分装每份300v1, - 20℃保存,dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。另外。现在已有中性dNTP溶液商品供应(Sigma公司和Pharmacia公司等)。

        (5)标本处理试剂:不同标本所需试剂不同,根据具体情况而定〔见本章第6节)

        二、操作程序

        利用PcR扩增的操作程序基本相同,只是根据引物与靶序列的不同,选择不同的反应体系与循环参数,基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中,然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。每个实验室或每个人都有不同的操作习惯,但需遵守一定的操作规范。我们推荐下述操作程序,因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。

        (1)向一微量离心管中依次加入:

        ddH2 O补至终体积(终体积50~100ul)

        10 x PCR缓冲液 1/10体积

        dNTP 各200umol/L

        引物 各1umol/L

        DNA模板

        混匀后,离心15s使反应成分集于管底。

        (2)加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。置反应管于97c变性7min(染色体DNA)或5min(质粒DNA)。

        (3)冷至延伸温度时,加入1—5U Taq DNA聚合酶,在此温度作用1min。

        (4)于变性温度下使模板DNA变性适当时间。

        (5)在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。

        (6)在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。

        (7)重复(4)一(6)步25—30次。每次即为一个PcR循环。

        (8)微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物(见本章第7节)。

        上述过程可以用PcR自动热循环仪进行,也可以设定3个恒温水浴锅手工操作。

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