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        基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列

        互联网

        5444

        原理

        基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子)或下游序列的方法。其原理如下:首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性内切酶消化基因组 DNA,然后将预先设计好的 DNA 接头连接在 DNA 的两端。

        这样的一组两端带有接头的 DNA 片段就称为所谓的无载体的 DNA 文库;根据接头和目的基因的序列设计两组引物,以上述的DNA为模板,先以外侧的一组引物进行第一轮 TD-PCR (touchdownPCR )扩增,然后以内侧的一组引物进行巢式 TD-PCR 扩增,扩增产物即为所需的DNA片段。

        在接头中,由于2条链中较短的一链的3’末端被 2NH2 封闭,使得引物 AP1 在第一次 PCR 之前没有结合位点,在 PCR 的第一循环过程中只能从 GSP1 延伸,没有 AP1 的延伸产物。而GSP1 的延伸产物产生了 AP1 的结合位点,在第二循环就开始从两端进行延伸反应。

        这样,就减少了非特异性扩增,从而提高了 PCR 的特异性.基因组步行由 2 轮 TD-PCR 反应组成。在 TD-PCR 的初始循环中,所采用的退火和延伸温度比引物的 Tm 值略高,在这种情况下引物退火的效率会下降,但是特异性将增加;另外,在极少数情况下接头的 2NH2 也会延伸,补平接头,这样也产生了 AP1 的结合位点,从而增加了非特异性扩增,但在高温下,接头的自我退火比引物与接头退火的效率高,就提高了针对于 AP1 的 PCR 抑制效应,减少非特异性扩增。

        在随后的循环中,退火和延伸温度比 Tm 值略低,有利于特异性产物的指数增长。基因组步行技术主要应用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆,该技术也可用于确定内元/外元的连接以及从任何序列标签位点(Sequence2tagged site,STS)或 EST 两端进行扩增获得相应的序列。

        尽管一次步行获得的片段长度短于 6 kb,但可通过多次反应获得更长的片段。该方法对于填补基因组中的一些间隙,特别是当这些缺失的克隆通过常规的筛选文库很难得到时非常有。

        一、高质量基因组DNA 的提取

        1 材料

        实验鱼,尾静脉取血100 μl(含抗凝剂)

        2 试剂

        QIAGEN Genomic 20/G;Tip Holders;Buffer C1;Buffer QBT;Buffer QF 抗凝剂 : 0.48%柠檬酸,1.32%柠檬酸钠,1.47%葡萄糖

        3.方法

        1)样品的处理和裂解

        (1)将100μl鱼血用PBS稀释至1ml

        (2)加入1倍体积冰冷的Buffer C1,3倍体积(3ml)的ddH2O 。

        (3)翻转数次至悬冷液成半透明

        (4)冰浴10min。

        (5)4℃,1300g离心15min,弃上清液。

        (6)加入250μl冰冷的Buffer C1,750μl冰冷的ddH2O。

        (7)轻弹,溶解沉淀。

        (8)4℃,1300g离心15min,弃上清液(如沉淀不是白色,重复洗涤步骤)。

        (9)加入1ml Buffer G2,最大速漩涡10-30s,充分重悬核酸沉淀物(时间要控制得很严格)。

        (10)加入25μl QIAGEN Protease,50℃保育30-60min(如有必要可延长保育时间)。

        2)DNA的提取

        二、基因组步行法扩增5’及3’侧翼序列

        1 材料

        基因组DNA


        2.仪器、用具

        离心机、PCR仪

        3.试剂

        (1)30μl DraⅠ(10units/μl)

        (2)10μl T4 DNA Ligase (6units/μl)

        (3)10×Ligation Buffer

        (4)BD Genome walker Adaptor (25 UM )

        (5)Adaptor Primer1 (AP1,10uM)

        (6)Nested Adaptor Primer2 (AP2,10μM)

        (7)酚

        (8)氯仿

        (9)3M 醋酸钠

        (10)95%乙醇

        (11)80%乙醇

        (12)TE: 10 mM Tris,0.1mM EDTA (10/0.1,ph7.5)

        (13)TE: 10 mM Tris,1mM EDTA (10/1,ph7.5)

        4.方法

        1)电泳检测基因组DNA质量

        取1μl Genomic DNA (0.1μg/μl)和1 μl Control genomic DNA (0.1 μg/μl),0.8%凝胶电

        泳检测基因组DNA质量。

        2)DraⅠ酶切检测Genomic DNA质量

        (1)于0.5ml离心管中加入

        (2)轻轻翻转离心管混匀(不要旋涡)。

        (3)37℃过夜。

        (4)取5μl反应液于0.8%凝胶进行检测,1 μl genomic DNA作对照。

        3)基因DNA Dra I 酶切

        (1)于1.5ml离心管中加入以下试剂:

        基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列


        (2)轻轻摇匀。

        (3)37℃保育2hr。

        (4)低速旋涡5-10s。

        (5)37℃温育过夜(16hr -18hr)。

        (6)取5 μl酶切产物于0.8%凝胶上进行电泳检测。

        4)DraⅠ酶切 DNA 的纯化

        (1)于1.5ml 离心管中加入等体积的 (95 μl)酚。

        基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列

        (2)低速旋涡5-10s。

        (3)短暂离心分离水相和有机物。

        (4)将上层水相吸至另一新1.5ml 离心管中,弃下层有机物。

        (5)加入等体积 (95 μl)氯仿。

        (6)低速旋涡5-10s。

        (7)短暂离心分离水相有机物。

        (8)转移上层水相至另一新1.5ml 离心管中,弃下层有机物。

        (9)加入2 倍体积 (190 μl)冰冷的95%乙醇。

        (10)加人1/10 体积 (9.5 μl)3M NaAc (pH4.5)。

        (11)低速旋涡5-10s (轻弹)。

        (12)14000rpm,离心10min。

        (13)倒掉上清,空气干燥沉淀。

        (14)加入20 μl TE (10/0.1 pH7.5)溶解沉淀

        (15)低速旋涡5-10s (轻弹)。

        (16)1 μl纯化产物于0.8%凝胶进行电泳检测。

        5)Genomic DNA 与 Genomewalker Adaptor 连接

        (1)于0.5ml 离心管中加入

        (2)16℃过夜

        (3)70℃保育5min

        (4)加入TE 72 μl (TE 10/1 pH7.5)

        (5)轻弹5-10s


        6)PCR

        (1)1st PCR

        ① 配制PCR反应液

        基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列

        ② 反应条件: 94℃ 25s,72℃ 3min ×7;94℃ 25s,67℃ 3min ×32;67℃7min。

        (2)2nd PCR

        1)取1 μl 1st PCR 产物49 μl ddH2O 中,稀释50 倍

        ① 配制PCR反应液

        基因组步行法扩增3’及5’侧翼序列

        ② 反应条件: 94℃ 25s,72℃ 3min ×5;94℃ 25s,67℃ 3min ×20;67℃7min。

        (3)取5μl 第二轮PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳片段克隆到pMD-18T载体,进行鉴定和测序。

        (4)获得基因组DNA 5’及3’侧翼序列后,将其与基因组DNA 的核心片断进行拼接。这就获得了基因组DNA的全序列。

        注:基因组步行法扩增5’侧翼序列和3’侧翼序列的方法相一致,只是PCR反应所用的接头引物和基因特异引物不同。

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