生物素标记凝集素的组织化学染色程序

互联网2010-12-02

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生物素标记凝集素的组织化学染色程序

生物素(biotin)与亲和素(avidin)具有非常高的亲和性。1分子亲和素可与4分子生物素结合。故可利用这一特点，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，再制备辣根过氧化物酶标记的亲和素―生物素复合物(avidin-biotin-peroxide complex，ABC)，该复合物可含数个辣根过氧化物酶分子。

又因复合物中的亲和素未被饱和，除与辣根过氧化物酶―生物素结合外，尚有一定的位点可与其他生物素结合。

因此，实验中可通过生化反应将凝集素结合在另外的生物素上．当标记生物素的凝集素与组织细胞膜的单糖结合后，再用ABC复合物中亲和素与该生物素结合，在糖基的位置可形成一个较大的复合物，以增加检测的敏感性。其染色程序如下：

1．切片脱蜡处理同前：

2．小鼠肝粉(10ug/ml，PBS配制)或生物素阻断剂孵育切片?室温10分钟，抑制组织中内源性生物素；

3．3％H2 O2 孵育10分钟(阻断内源性过氧化物酶，避免假阳性)，PBS漂洗2次，每次5分钟；

4．用适当稀释度的生物素标记凝集素室温孵育切片45分钟：

5．PBS漂洗2次，每次5分钟；

6．ABC液孵育切片．室温30分钟，用前配制，可按试剂盒说明书操作，将20ul亲和素加20ul HRP标记的生物素，溶解在1．0mlPBS中；

7．PBS漂洗2次。每次5分钟；

8．呈色加入DAB液暗处10～15分钟，室温；

9．流水冲洗；分钟，必要时可用苏木精复染，光镜观察记录；

10．结果阳性部位呈黄棕色。