抗体的生物素化标记

抗体生物素标记是指将标记物（生物素）共价偶联到抗体上，标记后的抗体蛋白与待检测物（如免疫蛋白）特异性反应形成多元复合物，并借助于酶标检测仪、流式细胞仪等精密仪器对试验结果进行自动化测定，从而对待测物进行定性和定量测定。

1、生物素标记抗体

（1）根据 Thermo 的说明书，将所用试剂及待标记抗体恢复至室温，称取一定量的生物素，使用无菌水溶解并稀释生物素至终浓度为 5.5 mg/mL。

（例：每 1.0 mg 生物素用 180 μL 的无菌纯水溶解成 5.5 mg/mL 的溶剂。）

（2）生物素与抗体质量比例为 5~20:1，将计算好的对应质量的生物素及待测抗体混合，总体积要大于 100 μL。

（3）室温下避光旋转反应1 h。

（4）反应结束后，用 1×PBS 溶液 4 ℃ 摇床透析过夜。次日，换新的 1×PBS 溶液继续透析 5 h。

（5）透析结束后，收集并分装，-80 °C 避光保存，长期保存可添加终比例为 60% 的甘油。

2、标记后抗体浓度检测

（1）利用 BCA 法测定标记后抗体浓度。用标准品稀释液将标准蛋白（0.5 mg/mL BSA）按所需梯度稀释加入到 96 孔板中，总体积为 20 μL。

（2）将待测抗体稀释 10 倍，加入 20 μl 稀释液至 96 孔板中（做复孔）。

（3）将 BCA 试剂盒中的 Solution A 摇晃混匀，根据样品数量，按 50 体积 Solution A 加 1 体积 Solution B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀。

（4）各孔加入 200 μL BCA 工作液，用加样枪轻轻吹打混匀，37 ℃ 恒温箱放置 30 min。

（5）冷却至室温后，用酶标仪测定 A562。

（6）根据结果绘制标准曲线并计算出样品中蛋白浓度。

1. 待标记物的蛋白浓度不能过低，如若浓度过低需经超滤浓缩等手段提高浓度至 0.1 mg/mL 以上。

2. 如果偶联基团为氨基，待标记物的系统不得含有游离的氨基（Tris, 氨基酸）、载体蛋白（BSA）或者其他干扰物，若有干扰物需要用标记缓冲液反复超滤确保其去除干净，若采用其他基团偶联试剂，待标记物系统亦不能有含对应的游离基团的物质。

3. 如果待标记物为分子量较小的物质，在纯化过程中注意超滤管、脱盐柱、透析袋的截留分子量。

4. 标记反应后的体积量至少在 100 μL 以上，以达到纯化时的最小上样量。

5. 标记反应完成后（氨基偶联体系），可在体系中加入适量的含游离含氨基小分子物质，中和游离的生物素活化试剂，提高纯化效率，减少后续反应的假阳性和高背景。

6. 纯化后的标记蛋白可采用 A280 或 BCA 法测定蛋白浓度。

7. 标记纯化后的蛋白可根据蛋白性质进行分装长期保存，减少冻融次数。