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        免疫共沉淀实验抗体的选择

        丁香园

        7583

        小弟是新手,刚开始做实验,向诸位请教一个问题。我要做一个蛋白的 IP,520个AA,58/55kDa,查文献都是用标签FLAG的抗体做的,但现在没有这个标签的真核表达载体,想直接转染后用目的蛋白的抗体做,不知 道可不可以?

        还有就是,什么时候用标签,什么时候可以不用?标签的选择有没有要求?请大家不吝指教,*!ps:小弟新虫,金币不多,大家见谅啊!

        问题:看的文献上都是用含标签的目的蛋白基因的载体转染细胞,然后做IP,我想,是不是目的蛋白的抗体不适合做IP,所以转染时需要加个标签,以便用标签蛋白抗体将目的蛋白沉淀下来?如果能直接用目的蛋白的抗体,那正是我所期望的,试验简单啊。

        回答:

        1、做Co-IP时是否选用Tag的抗体不是主要的,重要的是你用的抗体是否可以做IP以及IP的效果如何。所以说,如果你目标蛋白的抗体可以用于IP,且效 果好,就不需要顾及Tag的问题。

        单就Co-IP或IP而言,goat抗体最好,mouse次之,rabbit不是太好,这里好坏的重要标准之一是 Western blot时重轻链信号的干扰问题.

        2、抗体能用就不需要标签。

        3、这个没有标准答案,只有做了才知道。理论上都是可行的,实际上也都是可做的,但有时候因为有些内源性蛋白质表达水平很低,做起来比较困难。而transfection则可以根据意愿是蛋白浓度尽可能高些,这样做起来容易。还有,不知道你做IP的目的是什么,如果是研究蛋白间的相互作用,也可以考虑其他手段,如GST-pulldown assay等。



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