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        测定用乙醇固定的 DNA 的含量

        互联网

        2877

        一、培养细胞的 DNA 含量的测定

        制备单细胞悬液于 200μ l 的 PBS 缓冲液中; 加入 2ml 预冷的 70%乙醇,4℃保存;

        附:细胞固定的一般步骤

        1. 取单细胞悬液 1~2×106 个细胞于 PBS(PH=7.2)缓冲液中;

        2. 300g 离心 5 分钟,弃上清,反复两次;

        3. 重悬细胞于 0.5ml PBS 缓冲液中;

        4. 将细胞悬液放置于 2~3ml 冷 70%乙醇中,混匀,保存于4℃,至少30 分钟。 在 4℃条件下可保存 2~3 周。

        注意:

        1. 根据实验的要求,固定剂也可选用 1~3%多聚甲醛;

        2. 将乙醇作为固定剂时,乙醇应预冷至 0~4℃;

        3. 细胞在固定时,固定剂应缓慢滴入细胞悬液中,使固定剂的浓度缓慢增 加,并不断震摇,以免细胞成团(特别是用乙醇固定时) 。

        4. 300g 离心 5 分钟,去上清,再重悬于 400μ l PBS 中;

        5. 显微镜下观察,若有明显的黏附,须再用筛网过滤;

        6. 加入 PI(含 Rnase) ,避光孵育30 分钟;

        7. 上机检测。

        2、新鲜组织的 DNA 含量的测定

        1. 用 200mg 湿重组织用机械法制成单细胞悬液;

        2. 500g 离心 5 分钟;

        3. 弃上清,重悬于 10ml 染色- 去污剂中;

        4. 再过滤,用 200 目的筛网或 70~80μm 的筛网过滤;

        5. 上机检测。

        3、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定

        1. 从石蜡包埋切取切片 50 μ m 厚,2~3 片,制成单细胞悬液;

        2. 用 PBS 缓冲液洗涤,500g 离心 5 分钟,弃上清;

        3. 加入 PI 液 1ml 室温避光 30 分钟;

        4. 调整细胞浓度为 1×106/ml;

        5. 上机检测。

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