通过凝胶电泳测定λ噬菌体原种和裂解物中DNA的含量实验

本方案阐述了一种快速估计 λ 噬菌体原种中 DNA 含量的方法。该方法首先可用于发现原种和裂解物中的噬菌体颗粒的得率是否能满足大量纯化的需要，其次可用于检测纯化过程，以找到出问题步骤。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

2.5X SDS-EDTA 染料混合物

2. 酶和缓冲液

DNaseⅠ稀释缓冲液，胰 DNase Ⅰ (1 mg/ml)

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

4. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体 DNA ( 对照 DNA)

5. 专用设备

预置于 65℃ 的水浴

6. 载体和菌株

λ 噬菌体裂解物或原种

二、方法

1. 按如下方法配置胰 DNaseⅠ 的工作液（1 μg/ml)：1 μl DNase Ⅰ 储液加 1 ml 冰冷的 Dnase Ⅰ稀释缓冲液进行稀释。

2. 将封口的试管轻轻上下颠倒数次使溶液混匀，注意别产生气泡和泡沬。在使用前将工作液贮存于冰浴中，用后舍弃。

平板裂解物的粗制品得到一条清晰的 λ 噬菌体 DNA 带。但是，液体裂解物一般含细菌 DNA 片段，在琼脂糖凝胶中将干扰噬菌体 DNA 带。在用 SDS 和 EDTA 处理释放 λDNA 之前，先用胰 DNaseⅠ 处理噬菌体颗粒，将能避免该问题的产生。

3. 将 10 μl 噬菌体裂解物或原种的粗制品转移至一微量离心管中，加 1 μl 胰 DNase 工作液，37℃ 温育 30 min。

4. 加入 4 μl 2.5X SDS-EDTA 染料混合物，65℃ 温育 5 min。

这一步使噬菌体的外壳破裂，释放病毒 DNA，同时使 DNase 失活。

5. 将样品上样于含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 0.7% 琼脂糖凝胶中。

用 5 ng、25 ng 和 100 ng 的 λ 噬菌体 DNA 作对照。

6. 在小于 5 V/cm 的电场下电泳，直到溴酚蓝迁移 3~4 cm。

如果电压太高，DNA 带将出现拖尾现象。

7. 在紫外线下观察凝胶。用标准 DNA 的荧光密度作对照，估算测试样品中 λ 噬菌体 DNA 的量。

10 μl 的高滴度裂解物应含有 10~50 ng 的噬菌体 DNA。