DNA结台蛋白的分离及克隆

上面简单介绍了鉴定DNA结合元件所结合蛋白质的最常用的方法，对蛋白质更深入的分析应对其相应的基因进行克隆。基因克隆后，就可以通过基因突变判断蛋白质和某生物过程的关系，确定负责蛋白质活性的结构域，分析该蛋白质的作用机制和调控模式。

1. 蛋白质纯化法和序列分析法

克隆DNA结合蛋白，首选蛋白质纯化法，在得到氨基酸序列后，设计PCR简并引物，用于扩增基因片段，最后通过cDNA文库筛选得到全长cDNA。该方法在共价交联有目的DNA序列的寡核苷酸多联体的柱层析树脂中进行。

这种技术称为序列特异性DNA亲和层析。DNA亲和层析方法与常规的层析方法相似，但往往使用大量的蛋白质使层析柱超载，这样可以增加DNA亲和层析的成功率。

蛋白质纯化到某种程度后，在银染的凝胶上会看到一条带或多条带，因此需要进一步确定哪些条带的蛋白质与DNA结合活性相对应，可采用变性/复性、DNA―蛋白质印迹法及交联法进行确定。相对而言，变性/复性技术能够提供更多的信息。

首先通过SDS―PAGE分离DNA亲和纯化样品中的蛋白质。电泳后，用刀片将凝胶上相关泳道切成多个凝胶块。每个凝胶块中的蛋白质通过在合适的缓冲液中浸泡，进行变性，并从聚丙烯酰胺中洗脱。

洗脱后通过变性液逐级稀释成非变性缓冲液，使蛋白质复性，或者在非变性缓冲液中透析。然后，利用EMSA和DNase I足迹法分析每一个样品，确定特异性DNA―蛋白质结合活性的存在。

2. 氨基酸序列分析及基因克隆

对于已经确定具有DNA特异性结合活性的蛋白质可以通过测序获得蛋白质的部分肽段序列，也可以利用纯化的蛋白质制备抗体，筛选表达文库。

肽段测序法更为常用，具体过程是：将蛋白质通过化学法或酶切法切成小肽段，通过质谱进行测序，然后通过数据库检索进行分析，确定它们是否与已知蛋白质或表达序列标签相对应。如果相对应，其基因或基因片段可以通过合适的途径得到或通过RT―PCR进行分离。

可以利用简并引物，通过多种PCR方法分离基因片段。PCR产物可以直接测序，也可以克隆进常规载体后进行测序。

为了确认克隆得到的基因编码目的蛋白质，可通过两种方法进行验证：

①制备重组蛋白质，将该重组蛋白质的DNA结合特征和最初抽提物的DNA结合特征相比较，可以用EMSA方法检测迁移率是否一致，或者用DNase I足迹法观察保护模式是否相同。

②制备抗重组蛋白质或人工合成抗体的多肽，分析它们是否和抽提物及纯化蛋白质相互作用。抗体能够超变动或破坏利用抽提物观察到的EMSA复合体。

对于与DNA相互作用的蛋白质的克隆，也可以通过其他的方法进行，如酵母单杂交等。