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        DNA重组片段的转化及克隆和筛选

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        DNA连接与转化

        目的与原理

        转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组 子导入细菌的过程。转化技术在基因工程领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞,使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。

        二、材料和方法

        1.材料:大肠杆菌

        2.仪器:

        离心机 ,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜

        3.试剂

        LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ;

        TFB:10mM MES(pH 6.3),45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl

        三、操作步骤

        1. 感受态细胞融化(在手心)

        2. 加入溶于TE的待转化外源DNA,冰浴30min。

        3. 42℃热冲击2 min。

        4. 冰上2min。

        5. 加入0.4 ml LB液体培养基,37℃保温摇床45 min

        6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上,37℃培养。

        四、实验结果及分析:

        培养皿上有白色菌落和兰 色菌落,但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色,所以白色菌落说明转化成功;兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒 经过了酶切和连接,若是在原酶切位点的连接进行的转化,菌落为白色;若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化,菌落为兰色(说明在酶切上成功,连接上也成功,转化上也成功)。

        五、注意事项

        关键要严格控制热激时间,超过2min,则转化会失败。

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