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        多肽和蛋白质的分离

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  用经脱气的HPLC级水洗去反相柱的有机溶剂,梯度从100%有机溶剂到100%水,流速1 ml/min,持续15 min 以上。
         
        2.  以100%的TFA/乙腈缓冲液平衡柱子至柱压和光吸收值达到恒定。用10~15 min 的线性梯度使之逐渐转到0.1%TFA水溶液,并以0.1%TFA平衡15 min。

        3.  进行空白样品的层析检查柱子:流速1 ml/min,0~100%TFA/乙腈缓冲液线性梯度,时间45 min 以上,保持在100%TFA/乙腈缓冲液5 min,然后以15 min 的线性梯度回复到0.1%TFA,保持15 min。

        4.  将RP多肽恃准或多肽消化的混合物于5000 g 离心5 min。用HPLC只进样器吸取上清,并加之于注射样品环中。
         
        5.  按步骤3的梯度进行层析。收集层析峰于不同的聚丙烯管中。如果柱子的使用间隔时间超过两天时间的话,需要清洗柱子并贮存于有机溶剂中。
         
        6.  用TFA/胍缓冲液溶解收集到多肽,用旋涡混合器使之溶解。

        7.  在5 000 g 离心5 min, 并完成第二次如用于氨基酸序列分析,应直接将样品加到供测序用的玻璃纤维滤膜如用于氨基酸成分分析,在合适的容器中干燥小份样品并进行后续的水解。

        注意事项

        检测器的设定如下:对50 ~200 pmol 的多肽,满量程吸收单位为0.1,500 pmol 则为0.3AUFS,1 nmol 时为0.5 AUFS,2 nmol 为1 AUFS;对蛋白质而言,相应的设定应高2~3倍。

        来源:丁香实验

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