FISH步骤

1、脱蜡：

1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；

2）100％酒精两次，每次2min；

3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:

1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。

3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。

3、变性：

1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

3）78℃孵育8min；

4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；

5）空气干燥。

4、杂交：

1）准备探针；

2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：

5）镊子小心去除盖玻片；

6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；

8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

检测：

9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。

扩增：

12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；

15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：

1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；

2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。