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- 2025年07月29日
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北京百泰派克生物科技有限公司
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蛋白免疫印迹法步骤
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蛋白免疫印迹法步骤的技术解析
蛋白免疫印迹法步骤是分子生物学和生物化学研究中用于检测特定dànbáizhì表达水平的核心技术，其原理基于dànbáizhì的电泳分离、膜转移和抗体特异性识别。该技术通过十二烷基硫酸钠聚bǐngxīxiānàn凝胶电泳（SDS-PAGE）将dànbáizhì按分子量大小分离，随后通过电转印将凝胶中的dànbáizhì转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜上，zuì后通过一抗和二抗的级联反应结合化学发光底物实现目标蛋白的可视化检测。蛋白免疫印迹法步骤的灵敏度可达到皮克级别，且具备高度的特异性，因此在疾病标志物筛选、信号通路研究和药物靶点验证等领域广泛应用。
在蛋白免疫印迹法步骤中，样品制备是首要环节，需通过裂解缓冲液（如RIPA）提取总蛋白，并采用BCA或Bradford法进行定量以确保上样量一致。电泳阶段需根据目标蛋白分子量选择适当浓度的分离胶（通常为8%-15%），并加入还原剂（如β-巯基乙醇）破坏二硫键。转膜时需优化电流强度（常为100-300 mA）和转印时间（30-120分钟），以避免高分子量蛋白转移不wánquán或低分子量蛋白穿透膜。封闭步骤通常使用5%脱脂奶粉或BSA溶液，以减少非特异性结合。一抗孵育需根据抗体说明书选择适宜稀释比（1:500-1:5000）和温度（4℃过夜或室温1-2小时），而二抗则多选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。zuì后，通过增强化学发光（ECL）试剂显影，利用成像系统捕获信号。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。
蛋白免疫印迹法步骤的关键在于抗体选择与条件优化。例如，磷酸化蛋白检测需在裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂，而膜蛋白可能需要添加去垢剂（如Triton X-100）以提高溶解度。此外，内参蛋白（如β-actin或GAPDH）的使用是数据归一化的必要条件。值得注意的是，某些高分子量蛋白（>200 kDa）可能需延长转印时间或采用低浓度凝胶以提高转移效率。
常见问题：
Q1. 如何解决蛋白免疫印迹法步骤中出现的非特异性条带？
A：非特异性条带可能源于抗体交叉反应或封闭不充分。建议进行抗体预吸附实验，优化封闭剂浓度（如提高BSA至3%-5%），或采用与二抗相同种属的正常血清封闭。此外，适当增加洗涤次数（如TBST洗涤5次，每次5分钟）可减少背景信号。
Q2. 转膜后为什么会出现目标蛋白信号弱或无信号？
A：可能原因包括转印效率低（需检查膜与凝胶的紧密接触）、抗体效价不足（建议进行抗体滴定实验）或抗原表位被遮蔽（可尝试不同裂解缓冲液或抗原修复步骤）。对于低丰度蛋白，可改用高灵敏度底物（如超敏ECL）或延长曝光时间。
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文献和实验相关专题 主要包括以下 4 个基本步骤：样品制备；电泳分离；蛋白的膜转移；免疫 杂交与显色――蛋白检测。 溶液和试剂 1. 1X 磷酸盐缓冲液(PBS ) 2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4； NP-40: 1%；Na-deoxycholate: 0.25%；NaCl: 150 mM；EDTA :1 mM；PMSF: 1 mM
铵液中。 ⑵ 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4 ℃过夜。 ⑶ 1 500 g离心(4 ℃)2 h，去上清。仍加2%硫酸铵至100 ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。 ⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。 ⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。 ⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。 ⑺ 重复步骤⑹一次。 ⑻
Western Blot( 免疫印迹法 ) 主要包括以下 4 个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色��蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA
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