• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        原位杂交(以斑马鱼为例)

        互联网

        10969

        固定

        收集斑马鱼的胚胎,在Holfretor水中培养,到达所需要的发育时期时,用蛋白酶去除卵膜,用4%多聚甲醛固定,在4℃保存,二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗,然后换成甲醇,在-20C 保存,待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理,去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养,可阻断色素的形成)

        一. 原位杂交第一天

        1. 重新水化和固定

        1) 吸取固定好的胚胎,加入50%甲醇的PBST溶液,放置5分钟。

        2) 置换成30%甲醇的PBST溶液,放置5分钟

        3) 置换成PBST溶液,放置5分钟,重复一次

        4) 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟

        5) 用PBST洗两次,每次放置五分钟,室温。

        蛋白酶处理与后固定(本实验不做此步)

        1) 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理,5体节到24小时的胚胎处理3分钟,24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩,可以不用或者少用蛋白酶处理,发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织,以便于杂交。

        2) 用PBST溶液轻洗,在PBST中放置5分钟。

        3) 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟,室温

        4) 用PBST洗两次,每次放置五分钟,室温。

        2. 预杂交

        1)每个管中置换成大约300ulHYB-溶液,60℃水浴5分钟,避免振荡。

        2)用等体积的HYB+取代HYB-。

        3)60℃水浴,预杂交4小时以上。

        3. 杂交

        1)吸去预杂交的HYB+,加上100ul已加入探针的HYB+溶液(探针浓度约为1ng/ul)..

        2)60℃ 温浴过夜。

        注:杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等,温度越低,探针结合越好,温度越高,背景越小。

        二. 原位杂交第二天

        1.

        1)将探针回收,放于-20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

        2)加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,60℃,放置30分钟,重复一次。

        3)置换2XSSCT1ml,60℃,放置15分钟。

        4)置换0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分钟,重复一次。

        2.

        1)用MABT洗两次,每次五分钟,放在摇床轻轻摇动。

        2)室温下加1ml 1:2:7溶液,时间为一小时。

        3)按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体,4C 冰箱过夜。

        三. 原位杂交第三天

        1) 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液,放置摇床上25分钟,然后用1mlMABT置换,25分钟,再用1mlMABT溶液置换,一小时以上,最后用1mlMABT溶液置换,25分钟。

        2) 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次,每次放置五分钟

        3)将胚胎转入十六孔板中,吸去staining buffer,加上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用之前加5mM左旋米唑),十六孔板外面包上锡箔纸以避光,避免摇动,室温下显色。

        4)每隔一小时观察胚胎是否开始显色

        5)将显色完全的胚胎中的底物吸出,用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定,拍照。

        6)4C冰箱保存。

        原位杂交中溶液的配制:

        PBS:
        NaCl 8g
        KCl 0.2g
        Na2HPO4 1.44g
        KH2PO4 0.24g
        DEPC H2O 1L
        HCl 调PH值至7.4
        抽滤,灭菌

        4% 多聚甲醛:

        多聚甲醛 40g
        PBS 1L
        加热持续搅拌至溶液澄清。-20℃保存

        PBST:

        PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

        20XSSC:

        Na3Citrate 2H2O 88.2g
        NaCl 175.5g
        DEPC H2O 至1L
        抽滤,灭菌

        SSCT:

        SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。

        HYB-:

        甲酰胺:20XSSC储液:DEPC水=2:1:1配制
        加入Tween-20使其终浓度为0.1%,-20c保存。

        HYB :

        HYB- 20ml
        yeast RNA 10mg
        heparin 1mg。
        -20℃保存。

        MAB:

        maleic acid 11.6g
        NaCl 8.8g
        用固体NaOH(约7g)调至Ph=7.5
        4℃保存

        MABT

        MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.

        10% blocking reagent:
        blocking reagent 8g
        MAB 72ml

        1:2:7溶液:

        灭活羊血清:10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7
        用时现配

        Staining buffer:

        Tris 12.1g
        pH9.5
        Mgcl 6H2O 10.2g,
        Nacl 5.85g
        Tween-20 1ml,
        用之前加1M的左旋咪唑储液,使之终浓度为1mM

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序