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        斑马鱼精子复苏技术

        相关实验:斑马鱼精子冻存与复苏技术

        最新修订时间:

        简介

        斑马鱼精子复苏技术,是指将冻存的斑马鱼精子在 33℃ 水浴解冻,并尽量减少细胞损伤、激活受精反应。

        原理

        斑马鱼精子复苏技术的基本原理是将冻存的斑马鱼精子在 33 ℃ 水浴解冻,复苏时速度过慢,细胞内往往重新形成较大冰晶造成细胞损伤。

        材料与仪器

        器材:

        鱼缸、培养皿, 移液器、冰盒、勺匙 Eppendorf 管等。

        试剂:

        ① Hanks 储液(高温灭菌后 4 ℃ 保存)

        配制 Hanks 储液:

        储液#1: 8.0 g NaCl、0.4 g KCl,溶于 100 mL 双蒸水;

        储液#2: 0.358 g Na2HPO4 (无结晶水)、0.60 g KH2PO4,溶于 100 ml 双蒸水;

        储液#4:0.72 g CaCl2,溶于 50 ml 双蒸水;

        储液#5: 1.23 g MgSO4·7H2O, 溶于 50 ml 双蒸水;

        储液#6: 0.35 g NHCO3,溶于 10 ml 双蒸水。

        ② Hanks 预混合液(按顺序混合 10.0 mL 储液#1、1.0 mL 储液#2、1.0 mL 储液#4、86.0 mL 双蒸水和 1.0 mL 储液#5、4 ℃ 冷藏保存);

        ③ Hanks 液(:取 9.9 ml Hanks 预混合液,加入 0.1 mL 储液#6 即为 Hanks 液,4 ℃ 冷藏保存。分装在 1.5 ml 的 Eppendorf 管中,每管 100 μL,置于冰水浴待用。每管可用于复苏一份精子)。

        步骤

        斑马鱼精子复苏技术的基本过程可分为如下几步:

        A. 斑马鱼的准备:粘子复苏前一天晚将雌伯和雄鱼各一条隔离放置于配鱼缸中。第二天早晨取走隔板,密切观察行两条鱼追尾几分钟后(注意要在雌鱼产卵之前),取出雌鱼,将全部雌鱼合并放入同一个鱼缸中备用;

        B. 从液氮罐中取出需要复苏的精子样品,注意需两人操作,一个人提出冻存架,另一个人取出样品(冻存管)。用尖镊将一支毛细管从冻存管中夹出,交给提冻存架者用手捻融,同时尽快把其他样品(冻存管)放回冻存架,并将冻存架归位、盖上液氮罐;

        C. 把融好的精子吹到置于冰水浴中、含有 Hanks 液的 Eppendorf 管中,用移液枪吹吸混匀,置于冰水浴中待用。此时捞出雌鱼,挤压雌鱼腹部获取卵子,用勺子刮下,移液枪吸取稀释的精子滴入勺中(卵上),用 1 ml 移液枪吸取 1 ml 鱼水,将勺中的卵与精子一起冲到培养皿中;

        静置 1 分钟左右,待鱼卵外膜鼓起后再加鱼水至培养皿的一半,将培养皿(鱼卵)放置 28.5 ℃ 培养箱。30 分钟后即可观察受精情况。

        来源:丁香实验

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