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        乳酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法

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        3327

        乳酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法

        乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase,LDH)是辅酶I(NAD)依赖性脱氢酶,能氧化乳酸为丙酮酸,为无氧糖酵解途径的标志酶。硝基蓝四唑盐法显示LDH活性的原理与显示SDH活性的原理基本相同,只是需加用NAD,氢从反应生成的还原型辅酶I(NADH)传递给四唑盐,将其还原为甲脂。

        1)孵育液配液

        0.06mol/LPBS 0.25ml
        1.0mol/LD,L乳酸钠 0.1ml
        0.4%NAD 0.1ml
        0.4%NBT 0.25ml
        0.1mol/LKCN 0.1ml
        0.5mol/LMgCl: 0.1ml
        蒸馏水 10ml

        2)操作程序:

        ①固定:用预冷的2%多聚甲醛(0.1mol/LPBS,pH 7.4配制)灌注固定5分钟;
        ②洗涤:用冷PBS灌流冲洗固定液;
        ③取材:取所需组织,用PBS洗3次;
        ④切片:冰冻切片或振动切片,裱于涂有黏附剂的载玻片上:
        ⑤孵育:在上述孵育液中,暗处反应5分钟,室温下反应30分钟;
        ⑥封片:洗涤、脱水、甘油明胶封固和镜检。

        3)结果:

        酶反应阳性部位呈蓝色。该酶对固定剂的耐受性较好,采用先固定后孵育,可保存结构防止酶扩散。为了防止定位异常,在底物中加入聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP),可使底物黏稠度增加,防止反应产物扩散。

        4)对照实验:

        除去孵育液中的底物,结果应为阴性。

        乳酸脱氯建四唑盐法

        大鼠骨酪肌(舌)纤维横断面呈蓝色为乳酸脱氢酶阳性反应

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