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        MTT(四唑盐)比色法

        丁香园

        1634

        MTT 法是 Mosmann 1983 年报道的,以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比。再用酶标仪测定 OD 值。



        实验原理


        MTT 法是 Mosmann 1983 年报道的,以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比。再用酶标仪测定 OD 值。



        实验步骤


        一、实验前应明确的问题


        1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下,96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 105 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行 MTT 试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以保证培养终止致细胞过满。


        2. 药物浓度的设定。一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。


        3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值,输入 excel 表,最后得到不同时间点的抑制率变化情况,画出变化的曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。


        此处内容较多,有部分实验步骤省略,想查看更多详情,请点击「阅读原文」查看。


        二、贴壁细胞


        1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入 100 ul,铺板使待测细胞调密度至 1 000~10 000 孔,(边缘孔用无菌 PBS 填充)。


        2. 5% CO2,37℃ 孵育,至细胞单层铺满孔底(96 孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般 5~7 个梯度,每孔 100 ul,设 3~5 个复孔。建议设 5 个,否则难以反应真实情况。


        此处内容较多,有部分实验步骤省略,想查看更多详情,请点击「阅读原文」查看。


        三、悬浮细胞


        四、MTT 的配制


        五、细胞的接种(铺板)



        实验心得分享


        1. 吹打时悬液总量不能太多,达到吸管吸液量的 3~4 倍,可能比较容易混匀。10 ml 的离心管里面最好装 3~4 ml 的悬液:悬液太少容易吹起很多气泡,悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。


        2. 吸管的吸液量最好在 1 ml 左右:吸液量过多的话,一下吸起很多液体,管中所剩就很少,这样吹打容易起泡,吸液量过少,吹打的力度就不够,吹打就会不均匀。如果是吸液量 1 ml 多的吸管,总液量在 5 ml 左右为益。


        3. 吸的时候要在悬液底部,然后提起来一点,但是吹下去的时候不要离开液面,否则容易吹打出气泡。

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