琥珀酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法
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琥珀酸脱氢酶硝基蓝四唑盐法
在生物代谢过程中，由氢的供体(donor)把氢原子转移到氢的受体(receptor)的酶促反应称脱氢酶反应，该反应由脱氢酶(dehydrogenases)催化。脱氢酶种类很多，其活性均可通过四唑盐显示。四唑盐作为脱氢酶反应中的受氢体，接受脱氢酶作用于底物所释放的氢而形成有色的甲腊(formazane)，沉积于酶所在部位。
琥珀酸脱氢酶(succlnate dehydrogenase，SDH)是线粒体呼吸链的第一个酶，存在于所有有氧呼吸的细胞中，与线粒体内膜紧密结合，其活性反映三羧酸循环情况，是三羧酸循环标志酶，也是线粒体标志酶。SDH以黄素蛋白为辅基，能将琥珀酸氧化为延胡索酸并释放出氢，后者把硝基蓝四唑(NBT)还原为蓝色的甲膪。
1)孵育液配制
NBT 5mg
二甲亚砜(DMSO) 5.0ml
0．1mol/L琥珀酸钠 5.0ml
0．1mol/LPBS(pH 7．6) 5.0ral
注意：先用DSMO溶解NBT，然后加入琥珀酸钠和PBS。
2)染色程序：
①固定：固定剂很容易破坏SDH活性，故首选新鲜组织冰冻切片或用振动切片进行染色。对必须固定的组织，应降低固定剂浓度，如用0．25％～0．3％戊二醛或0．5％甲醛短时间固定(10～30分钟)，或用预冷的2％甲醛固定5分钟后再进行冰冻切片；
②洗涤：固定后需充分洗涤；
③切片：冰冻切片或振动切片机切片；
④孵育：暗处孵育，固定后的组织室温下孵育10～40分钟，未固定组织4℃孵育1―2小时，组织最初为红色，以后显蓝色。
⑤孵育后处理：水洗、晾于及油镜观察。
3)结果：阳性反应产物呈细小的紫蓝色颗粒，定位于胞质线粒体。甲脂阳性反应与细胞内线粒体数目呈正相关。
琥珀酸脱氢酶四唑盐法
大鼠肝细胞卞充满旱深蓝兰的琥珀酸脱氢酶阳性反应颗粒
4)对照实验：反应液中除去琥珀酸底物；在反应液中加入0．1mol/L丙二酸盐，琥珀酸脱氢酶可受到特异性抑制；加热处理使细胞内酶失活。
