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        转染

        互联网

        3942

        细胞传代

        (1) 试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。

        (2) 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。

        (3) 用Tip头加入1ml Trypsin液,消化1分钟(37。C,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

        (4) 加入1ml的含血清培养基终止反应。

        (5) 用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。

        (6) 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。

        (7) 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

        (8) 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。

        (9) 将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。

        细胞转染

        1)转染试剂的准备

        A. 将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。
        B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。

        2) 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。

        5) 将混合液在室温放置10―15分钟。

        6) 吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。

        7) 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。

        8) 到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

        第二次细胞传代

        1)在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

        2)再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

        3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

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