凝胶蛋白检测技术
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凝胶蛋白检测技术
理想的检测方法必须具有以下特点：
①良好的线性范围，即染色强度与蛋白质量成正比；
②良好的通用性，即对不同蛋白质具有相同的染色能力；
③良好的兼容性，检测后不影响后续的鉴定过程，即不影响蛋白质或多肽在质谱仪中的离子化过程；
④高灵敏度，检测出尽量多的低拷贝蛋白；
⑤高稳定性和重复性。但目前仍无完全符合上述条件的检测方法。
考马斯亮蓝染色、银染等各种传统显色技术对于蛋白质组学高灵敏度、高重复性、宽线性和高度自动化的要求逐渐显出局限性，目前不断有新的检测技术开发出来，如荧光标记、同位素标记等，但目前最常用的还是考马斯亮蓝染色和银染。
混合蛋白质经二维凝胶电泳分离后采用灵敏、合适的检测方法是呈现分离效果的关键步骤。
考马斯亮蓝染色的检测灵敏度约为0．1ug；银染则可检测到long的蛋白质；荧光染色的灵敏度是银染的两倍。经过考马斯亮蓝、荧光染色过的凝胶可以进行质谱分析，经普通银氨染色的凝胶则无法做质谱分析，快速银染法虽然检测灵敏度低于普通银氨染色法，且染色背景较深，但经过快速银染法染色的凝胶可以进行质谱分析。
(1)考马斯亮蓝染色的主要步骤：
①将凝胶移人一个盛有适量的染色液(脱色液I加入0．25％考马斯亮蓝R―250)的容器内，脱色摇床染色2h或过夜。
②弃去染色液，将凝胶在脱色液I(乙醇：冰乙酸：水＝25：8：65)中继续在摇床上震荡脱色。为脱色完全，需数次更换脱色液I。
③当凝胶上的斑点清晰、凝胶背景较浅时，倒去脱色液I，加入脱色液Ⅱ，凝胶置于脱色液Ⅱ(乙醇：冰乙酸：水＝10：15：175)中保存。
(2)快速银染的主要步骤：45％乙醇+5％乙酸固定60min，水洗每次45min，共2次。用0．02％Na2
S2
03
敏化l～2min，水洗每次1min，共3次。浸入0．1％AgNOa中，4℃放置30min，水洗每次1min，共3次。加入显影液(2％Na2
C03
含0．04％甲醛)，显影至蛋白质点清晰可见，倒出显影液，将凝胶保存在5％乙酸中。
