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        骨髓基质干细胞修复颅骨缺损

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        骨髓基质干细胞修复颅骨缺损

        1.实验动物

        毕格犬平均1岁龄,雌雄不限。氯胺酮10mg/kg肌内注射诱导后,肌内注射速眠新o.1m1/kg全麻,常规消毒、铺巾。16号骨髓穿刺针于髂前上棘或股骨近端穿刺,抽取骨髓3-5ml,置于50m1离心管中(所用器械均事先肝素化)。
        2.BMSC培养及成骨诱导

        3.细胞-生物材料复合物制备

        pDBM(脱钙骨基质,上海市组织工程研究与开发中心研制)预先制备成2.5cm×2cm×0.3cm片状,细胞培养同前一部分。每块材料接种4×106 经成骨诱导的BMSC,体外继续培养l~4天后,准备回植入动物体内。

        4.动物实验试验分组

        (1)实验组:颅骨缺损区植入pDBM/BMSC复合物。

        (2)材料对照组:颅骨缺损区植入单纯pDBM。

        (3)空白对照组:双侧颅骨区造成缺损后旷置。

        5.手术回植

        狗麻醉前禁食12 h,禁水4 h。氯胺酮10 mg/kg肌内注射,进行诱导麻醉,速眠新0.1m1/kg肌内注射麻醉,整个过程中动物保持俯卧位。

        动物麻醉平稳后,常规消毒铺巾,头部正中矢状切口,暴露双侧颅骨区,使用颅骨转,双侧各形成2.5cm×2cm全层颅骨缺损,同时去除缺损区骨膜,彻底止血。一侧缺损区为实验组,植入pDBM/BMSC另一侧为对照组植入无细胞单纯pDBM。

        6.术后新生骨的评价

        (1)三维CT检查:术后3、6个月颅骨三维CT检查。

        (2)大体观察:术后3、6个月取材时,暴露双侧颅骨区观察愈合情况。

        (3)组织学:术后3、6个月取材,实验侧和对照侧标本中部和边缘分别取材,石蜡包埋,组织学切片,进行HE和Azan三色染色。

        (4)硬组织切片和四环素标记新生骨:术后3、6个月取材,实验侧和对照侧标本中部和边缘分别取材,取材前2周静脉滴注四环素(10mg/kg)。

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