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        冰冻切片和石蜡切片的免疫组化染色步骤及荧光抗体染色方法

        互联网

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        速冻组织

          将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮内,大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。

          冰冻切片4~8mm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

          室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。

          PBS洗,5分钟×3。

          用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。

          PBS洗,5分钟×3。

          下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。

        石蜡切片免疫组化染色步骤

        三步法(以SP试剂盒为例)

          1. 石蜡切片脱蜡至水。

          2. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。

          3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。

          4. 5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

          5. PBS冲洗,2分钟×3次。

          6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。

          7. PBS冲洗,2分钟×3次。

          8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。

          9. PBS冲洗,2分钟×3次。

          10. 显色剂显色(DAB或AEC)。

          11. 自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。

        二步法(以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例)

          1. 石蜡切片脱蜡至水。

          2. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。

          3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。

          4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

          5. PBS冲洗,2分钟×3次。

          6. 滴加试剂1(Polymer Helper),室温或37℃孵育20分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。

          7. 滴加试剂2(poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG),室温或37℃孵育20~30分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。

          8. PBS冲洗,2分钟×3次。

          9. 显色剂显色(DAB或AEC)。

          10. 自来水充分冲洗,复染,脱水透明(如需要)、封片。

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