上篇：如何破解 PCR 常见问题？

PCR产物的电泳检测时间

一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规 则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带。

PCR反应的关键环节有：

1、模板核酸的制备；

2、引物的质量与特异性；

3、酶的质量及PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：

1、模板中含有杂蛋白质。

2、模板中含有Taq 敢种剂。

3、模板中蛋白质?有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。

4、在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

5、模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理 ，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定 不宜随意更改。

酶失活

需更换新酶或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够，而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq酶或溴乙锭。

引物

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高 ，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

对策为：

1、选定一个好的引物合成单位。

2、引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出 现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释 引物时要平衡其浓度。

3、引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏 部分，导致引物变质降解失效。

4、引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二 聚体等。

未完待续，下期我们来讲，那些影响 PCR 成败的最重要的 4 大因素

本文来源丁香园论坛，由作者：geentea创作

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