【交流】Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA)的原理

MLPA是一种高分辨率检测基因组序列中变异重复拷贝数的新方法，能检测到新的缺失和扩增， MPLA可以检测单一外显子的拷贝数的改变，能检测50～70个核苷酸的片断，操作只需要一台基因扩增仪和序列电泳系统。在相同的操作协议下MPLA有不同的应用。

MPLA可以对上达40不同的mRNA进行相对定量检测，以测定启动子甲基化状态，并可检出已知的突变和SNPs。因为探针具有非常短的识别序列MPLA可以用于局部降解的DNA，比如从石蜡包埋甲醛固定的组织中提取的DNA。

在MPLA，没有样本核酸，只有探针加入到样本中经PCR扩增。经过探针和目标序列的杂交，接下来是连接延伸反应，这样每个目标序列的拷贝就可形成。这些探针分子经过多重PCR扩增。MLPA使得每个特定序列的多重PCR多重PCR同时进行。

这种PCR反应十分强大，因为只有一对PCR引物加入到所有片段的扩增反应当中。扩增产物长度大约130～480bp，再经序列电泳仪分析。每个探针包括两个寡核苷酸，约46种不同的探针应用于MPLA。

其中一个寡核苷酸是合成的长度大约40～50核苷酸。另一个是phageM13的衍生物，长度大约80～440核苷酸。探针的两个寡核苷酸杂交序列约60～70bp，并与临近的目标序列互补。M13衍生的寡核苷酸探针有一个非杂交填充片段，不同探针其长度不同。

所有探针再其末端都有相同的PCR引物序列。经过探针和目标序列的杂交，接下来是连接延伸反应，这样每个目标序列的拷贝就可形成。每个探针有两个部分与目标序列杂交，耐热连接酶使之连接。只有当合成寡核苷酸和M13衍生的寡核苷酸片段分别与他们的目标基因完全配对时，它们才连接在一起

。样本中目标序列存在的数量决定了每个探针连接事件发生的次数。连接延伸反应之后，所有延伸产物被PCR扩增。所有延伸产物的扩增只需要一对引物。因为没有延伸探针同时可含有PCR探针序列，它们不能被指数级扩增。

即使MLPA扩增反应有非常大的复制能力，但有些序列在每个PCR循环的扩增率仅1-2%之低，使得相对较低的峰面积。因此一个单独的MLPA扩增不能提供我们需要的信息。对照一个控制反应，每个MLPA产物的相对峰面积反映了分析样品中相关目的序列的复制数。

一条染色体上一个或多个外显子的删除，在MLPA中显示为其探针扩增产物的相关峰面积的减少。MLPA试验被设计成，每个扩增产物在长度上是不同的。在现今可用的MLPA方法中，不同扩增产物的长度差异一般为9个核苷。MPLA扩增产物的长度在130到490核苷之间。

这是一个最佳长度，并且产生较低背景的序列类型胶体。特异性扩增产物的相对含量与探针拷贝目标基因的数目有关。扩增产物用毛细管电泳法鉴定和定量。与对照言本的比对决定了目标基因的拷贝数。