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        贴壁细胞如何进行传代?

        丁香园

        17347

        贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶,其作用是切断细胞和容器之间,细胞与细胞之间的相互粘连,用蛋白酶处理细胞的过程叫做「消化」,「消化」之后的下拨会形成单细胞并从容器底部掉下来。最常用的蛋白酶是胰蛋白酶。

        材料准备:

        1、预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37℃ 水浴锅内预热;
        2、用 75% 酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手;
        3、正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且减少污染;
        4、点燃酒精灯:注意火焰不能太小。

        传代流程:

        1. 取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
        2. 从培养箱内取出细胞:注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。
        3. 将培养瓶放入超净工作台后打开瓶口,同时要在酒精灯上烧口消毒。
        4. 加入消化液:小心吸出旧培养液,用 PBS 清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞较好好,消化温度是 37℃。
        5. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。
        6. 弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。
        7. 将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。平衡后将离心管放入离心机中,以 1000 rpm/min 离心 5 min。
        8. 弃去上清液,加入适当体积的培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
        9. 将细胞悬液吸出分装至 2 - 3 个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。
        10. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于 5×105 /ml。最后要做好标记。
        11. 继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 - 4 h 后开始贴附在瓶壁上。

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