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        类器官的传代和冻存

        相关实验:🔥 类器官培养

        最新修订时间:

        材料与仪器

        DMEM,冻存管,移液器,离心机

        步骤

        类器官传代

        (1)轻轻吸去培养基,各孔加入 500μl 凝胶消化液(以 24 孔培养板为例);

        (2)使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端,并用该枪头尖端将步骤(1)中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打,吹打时避免产生气泡,将胶滴吹散,放入冰盒上消化 20 min;

        Tips:

        1. 建议尽可能将胶滴吹散,避免影响消化效率。
        2. 使用移液器吹打时,应避免移液枪头尖端接触到皿底。

        (3)消化好的细胞悬液收集到 15 ml 无菌离心管中,加入 10 ml 无菌 D-PBS 溶液,4℃ 条件下 rcf 200g 离心 5min,弃上清;

        (4)向沉淀中加入类器官消化液,37℃ 静置消化,每隔 5min 取出,机械吹打 10~15 次后镜检,直至消化成细胞团;

        (5)进行接种培养。依据类器官的密度和状态按照 1:2~1:6 的比例传代。

         

        类器官冻存

        (1)轻轻吸去培养基,各孔加入 500μl 凝胶消化液(以 24 孔培养板为例);

        (2)使用凝胶消化液润湿 1 ml 的枪头尖端,并用该枪头尖端将步骤(1)中的胶滴从皿底彻底刮除。用移液器反复吹打,吹打时避免产生气泡,将胶滴吹散,放入冰盒上消化 20 min;

        Tips:

        1. 建议尽可能将胶滴吹散,避免影响消化效率。
        2. 使用移液器吹打时,应避免移液枪头尖端接触到皿底。

        (3) 消化好的细胞悬液收集到 15 ml 无菌离心管中,加入 10 ml 无菌D-PBS 溶液,4℃ 条件下 rcf 200g 离心 5min,弃上清;

        (4) 加入 3ml 的 Advanced DMEM/F-12 重悬类器官,4℃ 条件下 rcf 200g 离心 5min;重复此步骤三次,彻底清洗类器官。根据类器官的数量加入合适体积的类器官冻存液;

        ※以类器官计数结果为 200 个类器官为例,加入 1ml 类器官冻存液,充分重悬类器官;

        (5) 将类器官悬液转移至冻存管中,程序性降温至 -70℃ 以下后,转移至液氮中长期保存。

        来源:丁香实验

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