WB结果背景过高原因之：“心急吃不了热豆腐”
&丁香园
9840
天热了，心情难免烦躁一些。这一来WB也出鬼了，胶片上不时的出现极高的背景，整张膜上都是黑的，看上去好像是在墙壁上泼墨后留下的污渍似的。
跑胶的问题？
转膜？
显影？
……？
重复……
重复，重复……
重复，重复，重复……
直到某天早上我咬牙切齿的盯着那几条蓝色的带往下跑的时候，蓦然发现：浓缩胶漏了！从某个梳孔的角落处，溴酚蓝正直接穿过浓缩胶，进入浓缩胶和分离胶的交界处，并顺着交界线平展开来，渗透到整个交界线上。显然这将直接导致样品在整个膜里面分布，造成高背景。因为漏的样品分布相对均匀，所以丽春红染色是看不出来区别的。
似乎是找到原因了。为什么会这样呢？很显然：拔梳子的时候太快，带动了浓缩胶。“心急吃不了热豆腐”嘛，呵呵！于是马上重新制胶，很小心的拔出梳子。看着那漂亮的梳孔，我得意的点上了样。
不料，这一次又漏了！而且比上一次还要严重，几乎所有的梳孔都漏了，在浓缩胶里面形成了一个蓝色蜘蛛网似的图案。我被击溃了。同样的溶液，同样的玻片，同样的人；更精确的取液，更小心的操作~~~咋会比上次更差呢？呆坐了几分钟（好像有一个世纪那么长）~~~到底谁动了我的浓缩胶？！？！？！？！？！
从刑侦角度来说，凶手应该是与被害人有直接或者间接接触的。和浓缩胶接触的东西有那些？玻片，梳子，SDS-PAGE Buffer，可能还有我的上样针头？
当我想到最后一样的时候，答案找到了：分离胶。
很简单：我没有等分离胶完全聚合，而是在其界面刚刚出现的时候就开始制备浓缩胶。大家知道，分离胶在聚合之后它的体积是会有所缩小的——虽然其液面只有1-2mm的降低（在我的BIO-RAD 的0.75mm kit上），但是这足以将两层胶撕开。而浓缩胶因为浓度比较小（更软）而更容易受影响。同时这也解释了为什么第二次我匆匆忙忙制备的胶更容易漏了。
于是第三次制备分离胶胶，等上1hour再上浓缩胶……这一次终于不漏了，而WB的结果也恢复了以前的干净整洁。接下来的几个蛋白也跑的顺顺利利的，感觉就像是：“我就抓住苍蝇挤破它的肚皮把它的肠子扯出来再用它的肠子勒住它的脖子用力一拉，呵－－！整条舌头都伸出来啦！我再手起刀落，哗－－！整个世界清净了。”
心情高兴中，特发帖希望能够提示一下有类似问题的朋友。还是那句话：“心急吃不了热豆腐”啊！
