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        轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

        丁香园

        6706

        最近 CRISPR/Cas9 基因敲除技术可谓风靡全世界的实验室,CRISPR 被称为规律成簇间隔短回文重复,其实际上就是一种基因编辑器,是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统。

        后来,研究人员发现,它似乎是一种精确的万能基因武器,可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因。由于其相对于前几代基因敲除技术而言更为简便高效。所以一经问世便受到科研界的热捧。利用 Cas9 质粒建立 knock-out 细胞系实验过程主要有以下几步:

        1. 确定待敲除基因的靶位点;

        2. 设计识别靶位点识别的一对 DNA Oligo(引物);

        3. 构建表达 sgRNA 的质粒 ;

        4. sgRNA 活性检测;

        5. 利用 Cas9 质粒建立 knock-out 细胞系 。

        本实验室老师也想跟跟潮流,弄个敲除细胞系出来,于是本小硕就被打发过来进行 CRISPR/Cas9 技术的学习,刚开始是一头雾水,后来在咨询有过分子生物学基础的博士师姐及科室其他老师后,终于是摸到一点门道了。

        我们都知道 gRNA 的设计对于 CRISPR/Cas9 基因敲除至关重要,而 gRNA 设计的关键是寻找正确的 CDS 序列。所以在这里首先给大家介绍的是 Cas9 质粒构建的第一个拦路虎,如何寻找目的基因的 CDS 序列。

        1. 在 NCBI 的 Gene 数据库中输入目的基因名称(以 p53 为例)

        轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

        2. 找到对应种属的目的基因,这里选择人源的话是第二个、点击(方框内)

        轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

        3. 进入后找到 Genebank 选项、点击(往下拉慢慢看)

        轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

        4. 进入后找到 CDS 区中的 CCDS(方框中),点击

        轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

        5. 找到对应的 CDS 区

        轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

        6. 将红色以及蓝色的部分间隔的输入麻省理工设计 gRNA 评分网址后根据评分选择分数较高的 3-5 对 gRNA 即可。

        这里需要区分解释的几个名称是 mRNA 与 CDS 的区别于联系,只有一部分 mRNA 可以将来翻译为蛋白,这部分叫 CDS(编码序列),就是起始密码子和终止密码子之间那一段。其余的 mRNA 叫 UTR(非翻译区),那么 mRNA 就由 5'UTR,CDS 和 3'UTR 组成。而 CDS 区也包含了内含子与外显子。需要注意的是第 4 点图中红蓝区分的是两段外显子,有可能是跨内含子的。所以网站用不同的颜色将之区分开来。大家设计 gRNA 时也要注意。

        好了,这期的 CRISPR/Cas9 基因敲除技术就讲到这里。有兴趣的童鞋请继续关注生物学霸后期关于 CRISPR/Cas9 基因敲除技术的微信文章。

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