GENETICS：用于检测哺乳动物细胞中 DNA-蛋白质交联质粒修复的简单、快速的定量分析

该方法的目的是提供灵活，快速和定量的技术来检测哺乳动物细胞系中DNA-蛋白质交联（DPC）修复的动力学。该测定不是全局测定异种生物诱导的或自发的染色体DPC去除的去除，而是检查在质粒DNA底物内的一个位点处特异性引入的均匀的，化学定义的损伤的修复。

这种方法避免了放射性物质的使用，并且不依赖昂贵的或高度专业化的技术。相反，它依赖于标准的重组DNA程序和广泛可用的实时定量聚合酶链式反应（qPCR）仪器。考虑到所用策略的固有灵活性，可以改变交联蛋白的大小以及化学连接的性质和连接位点的精确 DNA 序列环境以解决这些参数对整体效率的各自贡献DPC修复。

使用该方法，将含有位点特异性DPC的质粒转染到细胞中，并在转染后不同时间回收低分子量 DNA。然后使用与质粒的受损链互补的引物对回收的 DNA 进行链特异性引物延伸（SSPE）。由于DPC损伤阻断 Taq DNA 聚合酶，因此可以使用qPCR定量评估修复与未修复的DNA的比率。循环阈值（CT）值用于计算各个细胞系中不同时间点的百分比修复。这种SSPE-qPCR方法也可用于定量评估任何阻断Taq聚合酶的DNA加合物的修复动力学。

实验材料