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        哺乳动物 DNA 的快速分离

        相关实验:哺乳动物 DNA 的快速分离

        最新修订时间:

        原理

        根据本方案制备的哺乳动物 DNA 约 20~50 kb,适于作 PCR 反应的模板。DNA 产量在 0.5 到 3.0 μg/mg 组织之间变化,或者是 5~15 μg/300μl 全血。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液及溶液

        细胞裂解缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),1 mmol/L EDTA ( pH 8.0),0.1%(m/V) SDS)

        乙醇

        异丙醇

        醋酸钾溶液(60 ml 的 5 mol/L 醋酸钾,11.5 ml 冰醋酸,28.5 ml 水)

        红细胞裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl (pH 7.6)

        TE ( pH 7.6)

        2. 酶及缓冲液

        无 DNase 的 RNase ( 4 mg/ml)

        蛋白酶 K ( 20 mg/ml)

        3. 专用设备

        连有真空管的抽吸装置

        微量离心研棒

        预先调到 55℃ 或 65℃ 的水浴

        4. 细胞和组织

        哺乳动物组织或全血

        二、方法

        1. 准备用于分离 DNA 的组织或全血

        (1) 组织

        ① 切下 10~20 mg 组织。

        ② 用剃刀或解剖刀切碎组织或者将组织冷冻于液氮中,用在液氮中预冷的研钵研磨成粉。

        (2) 血液

        ① 在两个微量离心管中分别转移 300 μl 全血样品。每管中加入 900 μl 红细胞裂解缓冲液,盖上盖子,颠倒混匀。溶液于室温下放置 10 min, 中间颠倒混匀几次。

        ② 室温下用最大转速离心 20 s。

        ③ 每管保留 20 μl 上清,弃去其他部分。

        ④ 用剩余的少量上清重悬白细胞沉淀。将两管中的沉淀合成一管。

        2. 将切碎的组织或者重悬的白细胞沉淀转移到加有 600 μl 冰冷的细胞裂解缓冲液的离心管中。用微量研棒迅速研磨 30~50 下,混匀悬浊液。

        3. (可选择的)向裂解产物中加入 3 μl 蛋白酶 K, 以增加基因组 DNA 的产量。消化液置于 55℃ 放置 3 h 以上,但不要超过 16 h。

        4. 消化液降至室温,然后加入 3 μl 4 mg/ml 的无 DNase 的 RNase。37℃ 放置 15~60 min。

        5. 将样品降至室温。加入 200 μl 醋酸钾溶液,剧烈振荡 20s 使其充分混合。

        6. 用最高转速 4℃ 离心 3 min, 使蛋白/SDS 复合物沉淀出来。

        7. 将上清转移到加有 600 μl 异丙醇的新离心管中。充分混合,然后用最大转速室温下离心 1 min 收集 DNA 沉淀。

        8. 吸去上清,加入 600 μl 70% 的乙醇。颠倒管子数次,用最大转速室温下离心 1 min。

        9. 小心吸去上情,空气中干燥 DNA 沉淀 15 min。

        10. 将 DNA 沉淀溶解于 100 μl TE ( pH 7.6)。

        来源:丁香实验

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