Cell Research | 中科院王金勇/刘兵团队首次利用诱导多能干细胞实现体内 T 免疫系统高效重现
作为体内最重要的免疫细胞之一，T 细胞在机体抗病毒、抗肿瘤等方面发挥着重要的作用。特别是在免疫治疗高速发展（如 CAR-T）的今天，T 细胞相关的免疫疗法已成为治疗恶性肿瘤的新方法，并且取得了良好的效果。
但是，患者本身的 T 细胞存在功能异常，而其他供体的 T 细胞又会产生免疫排斥反应，因此阻碍了该疗法的普及。
目前，关于人体细胞来源的诱导型多能干细胞（iPSC）的研究逐日增多，因此通过诱导 iPSC 定向分化为 T 细胞将会成为用于治疗的重要细胞来源。
长期以来，人们通过体外模拟 T 细胞发育的微环境及干预 T 细胞发育成熟相关的重要信号通路，再利用和造血干祖细胞共培养的方法，能够在体外产生 T 细胞。然而，这种体外产生的 T 细胞并不能实现成功的移植，因此也就没有办法在体内发挥正常的 T 细胞功能。
另外，随着单细胞技术的日新月异，人们对造血的层级分化模型有了更新的认识。
同时，越来越多的证据也表明在 HSC 出现之前，HSC 非依赖的血细胞就已经出现，T 细胞就是其中一种。而这种 HSC 非依赖的 T 细胞的内在调控机制却知之甚少，这种内在调控机制是否能够帮助科学家们重建 PSC 诱导来源的 T 淋系免疫系统呢？
2019 年 11 月 15 日，来自实验血液学国家重点实验室、中科院广州生物医药与健康研究院的王金勇团队联合蛋白质组学国家重点实验室、解放军总医院第五医学中心的刘兵团队在 Cell Research 上发表了题为《Guiding T lymphopoiesis from pluripotent stem cells by defined transcription factors》的研究论文。
该研究首次通过串联表达转录因子 Runx1 和 Hoxa9 的方法，在体外体系产生 iPSC 来源的 T 系祖细胞并经过动物移植实现体内 T 免疫系统重建。
图片来源：Cell Research
文章亮点
1、首次通过 iPSC 方法体外诱导出能够在体内高效重建 T 免疫系统并稳定发挥正常 T 细胞功能的细胞；
2、这种体内重现的 T 细胞在中枢及外周免疫器官中均有分布并且能够发挥免疫排斥及抗肿瘤功能；
3、利用单细胞转录组技术，在单细胞维度上重绘了从 PSCs 向 T 谱系发育的轨迹，揭示了在生血内皮阶段 T 细胞的谱系命运就已经被决定。
文章思路
鉴于 Runx1 在内皮到血的转换（EHT）、成年造血及 T 细胞发育中发挥着关键的作用。
所以，研究人员首先构建了可诱导表达 Runx1 的胚胎干细胞细胞系（iRunx1 -ESC），并进行了 T 淋系分化（下图 a），但是该体系下产生的细胞并不能在移植后的体内产生 ESC 来源的 T 细胞。
研究人员设想可能是因为在体外培养体系中缺少了某些必须的调控分子。
因此，他们对 iRunx1 -ESC 来源的生血内皮细胞 (iHEC) 进行了单细胞测序，并将此结果与小鼠胚胎 E11 的 T1 -pre-HSC（该数据是刘兵老师 2016 年发表在 Nature 上的单细胞转录组数据）进行比较（下图 b）。
他们发现，与体内相比，体外体系中缺少诸如 Hoxa5\Hoxa9\Hlf 等转录因子，这些转录因子在造血发育中发挥着重要的作用。
图片来源：Cell Research
接下来，他们通过串联表达 Runx1 和上述缺乏的转录因子，也就是借助「外力」扭转这些在体外体系中低表达转录因子的表达水平。
通过层层筛选，他们发现在分化的第 6 - 11 天诱导外源性 Runx1 和 Hoxa9 的表达可以产生丰富的 iHEC，继续培养可以获得包含 T 系祖细胞的 iHPC，将这些 iHPC 移植到经致死剂量照射处理过的 B-NDG 小鼠中。4 周后，可以在受体小鼠中检测到外源的 CD45.2 +CD3 + T 细胞（下图 a），并且 5 组独立实验均能证明该结果的可信程度（下图 b）。
图片来源：Cell Research
在成功地检测到供体来源的 T 细胞之后，作者进一步分析了这种诱导型 T 细胞的组织分布及 TCR 多样性。
他们发现这些 T 细胞在中枢及外周免疫器官中均可重现，另外转录组测序及 TCR 深度测序的结果表明，iT 细胞与天然发育的 T 细胞极其相似并且具有丰富的 TCRab 多样性。
图片来源：Cell Research
为了排除微环境因素及其他细胞类型造成的假阳性结果，另外也为了进一步证实 ESC 分化再生 T 细胞的效率，研究人员分选单个 iHEC 进行单细胞培养（下图 a/b）。
他们发现，这些单细胞可以在体外高效再生 iT 细胞，另外单个造血集落还可以在体内重建 T 淋系发育（下图 c/d）。
图片来源：Cell Research
以上的实验及数据均能证明 iT 的存在及能够实现成功的移植，但是这种移植成功后的 iT 细胞是否具有真实的功能呢？
为了回答这个问题，实验人员在小鼠的皮肤上进行了异体免疫排斥实验，发现 iT 细胞能够发挥免疫监视的功能并介导免疫排斥反应（下图 a/b）。
图片来源：Cell Research
随后，研究人员利用基因编辑的方法将肿瘤抗原特异性 TCR（MHC-I 限制性 OVA TCR，OT1）插入 iR9 -iPSC 细胞中得到 OT1 -iR9 -iPSC，并将诱导产生的 OT1 -iHPC 细胞移植到肿瘤模型老鼠中（下图 a），结果表明经 TCR 修饰后产生的 iT 细胞具有抗肿瘤活性（下图 b）。
结合上面的异体皮肤免疫排斥实验，这些结果均表明 iT 细胞与天然 T 细胞具有相似的功能。
图片来源：Cell Research
综上所述，该研究首次通过串联转录因子（Runx1 和 Hoxa9）的方法建立了体外诱导多能干细胞定向分化为 T 细胞并成功实现体内移植的体系。这种体外诱导的 T 细胞具有和天然 T 细胞相似的功能，能够在体内重建 T 免疫系统并可实现抗肿瘤的功能。
前期研究
其实，这并不是王金勇老师课题组第一次做 Hoxb 家族相关的研究。之前，王老师团队利用重编程技术，成功将 B 细胞转变为功能性的 T 细胞，而发挥这种能够转变细胞命运功能的转录因子正是 Hoxb 家族的一员 --Hoxb5，该成果发表在了 2018 年的 Nature Immunology 杂志上。
图片来源：Nature Immunology
2016 年，刘兵课题组联合其他团队在 Nature 以 Article 的形式发文，首次在单细胞维度解析造血干细胞的形成过程，这是国际上首次在单细胞水平上系统、深入地研究了小鼠造血干细胞形成和特化过程中的关键特征。
本研究中所用到的体内参考数据正是来自于这篇文章。
图片来源：Nature
另外，在今年 9 月 9 日，刘兵团队在 Cell Research 发文，通过分析人胚单细胞转录组数据，首次报道了人第一颗 HSC 的产生过程及其分子特征。
图片来源：Cell Research
总之，该研究利用多能干细胞作为「源材料」，通过串联转录因子的方法，首次运用体外体系诱导出能够成功重建 T 免疫系统，而这种诱导来源的 T 细胞同时具有免疫排斥及抗肿瘤的作用。
因此，这种具有治疗功能的 T 细胞将来可以用来进行肿瘤的免疫治疗或者用于治疗免疫缺陷疾病，如艾滋病或者先天性免疫缺陷症，为转化医学提供了新的技术借鉴和支撑。
参考文献：
1.Rongqun Guo，F.H. Guiding T lymphopoiesis from pluripotent stem cells by defined transcription factors. Cell Research (2019)
2.Schmitt, T. M. & Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like- 1 in vitro. Immunity 17, 749–756 (2002).
3.Mohtashami, M. et al. Direct comparison of Dll1 - and Dll4 -mediated Notch activation levels shows differential lymphomyeloid lineage commitment outcomes. J. Immunol. 185, 867–876 (2010).
4.Montel-Hagen, A. et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 24, 376–389 e378 (2019)
5.Mengyun Zhang, Y.D.Transcription factor Hoxb5 reprograms B cells into functional T lymphocytes. Nature Immunology (2018).
6.Zhou, F. et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature 533, 487–492 (2016).
7.Yang Zeng，J. H. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.Cell Research (2019)
