• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        四唑盐(MTT)比色法

        互联网

        2639

        四唑盐(MTT)比色法
        仅供参考 MTT常用浓度为5mg/ml;
        向大家推荐一本书
        《动物细胞培养--基本技术指南》
        注:此书中MTT浓度为50mg/ml
        1、药物的细胞毒性
        四唑盐(MTT)比色法
        操作步骤
        接种细胞
        (1)用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞,将细胞收集到含血清的培养基中。
        (2)离心细胞悬液,使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞,计数。
        (3)将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。
        (4)用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液,每孔加0.5×103-10×103 个细胞。
        (5)将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。
        (6)将培养板放至塑料饭盒中,于37℃湿润环境中温育1-3天,等细胞进入指数生长期时可加入药物。
        添加药物
        (7)用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释,共制备8个浓度。
        (8)对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列各孔的培养基。
        (9)在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基,这些细胞作为对照。
        (10)在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D行可用于第一种药物,E-H行用于第二种药物。
        (11)向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。
        (12)将培养板放回塑料盒中,温育至确定时间。
        生长期
        (13)在药物作用期结束时,去除所有含有细胞的孔中的培养基,加入200μl新鲜的培养基。
        (14)每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。
        存活细胞数的估算
        (15)在生长期末,每孔中各加入200μl新鲜的培养基,在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
        (16)用铝箔包裹培养板,于37℃湿润环境中温育4 h。
        (17)弃去孔中的培养基和MTT,在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,以溶解残留的MTT-甲�结晶。
        (18)在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液(每孔25μl)。
        (19)立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。
        分析
        以药物浓度为横坐标(X轴),吸光值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值,对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。

        四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝,
           四唑盐比色法的原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。
        无菌材料
           生长液;胰蛋白酶(0.25%+EDTA,1mmol/L,溶于PBSA中);MTT: 3- (4,5) -双甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑,50mg/ml,滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液(0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH将PH调至10.5 );微滴定板(Linbro,ICN); 微吸头,最好放在高压灭菌的吸头盒中。
        非灭菌材料的准备
           塑料盒(无毒的聚苯乙烯,装培养板用);加样器;DMSO;ELISA读板仪。


        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序